Name: Extraindo o módulo de Young de membranas basais pulmonares murinas nativas de mapas de força derivados de microscopia de força atômica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-31T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Aprenda a extrair o módulo de Young de membranas basais pulmonares murinas usando microscopia de força atômica e análise em MATLAB. Este método preserva propriedades mecânicas nativas para estudos de invasão celular.

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<table><tbody><tr><td>Seringa de 1 mL</td><td>B Braun</td><td>9166017V</td><td>Injekt-F</td></tr><tr><td>Seringa de 10 mL</td><td>B Braun</td><td>4606108V</td><td>Injekt Luer Solo</td></tr><tr><td>15 mL Falcon tubo</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.002</td><td>com tampa de rosca</td></tr><tr><td>Cantilever - MLCT</td><td>Bruker AFM Probes</td><td>3444</td><td>AFM cantilever com uma ponta piramidal em forma de lâminas</td></tr><tr><td>criotomóides</td><td>Leica Biosystems</td><td>14035843496</td><td>Lâminas descartáveis de baixo perfil DB80LX</td></tr><tr><td>Suporte de amostra de criotomo</td><td>Leica Biosystems</td><td>14047740044</td><td>Disco de amostra 30</td></tr><tr><td>Cyotome</td><td>Leica Biosystems</td><td>CM1950</td><td>Leica Cryostat</td></tr><tr><td>Direct Overlay Extension</td><td>Extensão do software Bruker</td><td></td><td>para o software JPK SPM que permite importar a imagem óptica do microscópio invertido para o Data Viewer do software SPM.</td></tr><tr><td>Molde de base descartável</td><td>Science Services</td><td>SA62534-15</td><td>Tissue-Tek Cryomold 15x15x5 mm</td></tr><tr><td>Fita dupla face</td><td>tesa Film</td><td>56661-00002</td><td>Fita de filme fotográfico</td></tr><tr><td>Suporte de cantilever de mola fixa</td><td>Microscópio</td> invertido Bruker <td></td><td></td></tr><tr><td>- Leica DMi8</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JPK Palco motorizado</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JPK NanoWizard 4XP BioScience</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JPK SPM Software</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>K5 CMOS Microscópio Kamera</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td></td><td>Versão R2024a ou superior</td></tr><tr><td>MATLAB - Caixa de Ferramentas de Ajuste de Curva&nbsp;</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB - Caixa de Ferramentas de Processamento de Imagem</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB - Caixa de Ferramentas de Processamento de Sinais&nbsp;</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB - Caixa de Ferramentas de Estatística e Aprendizado de Máquina</td> Lâminas de microscópio <td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Carl Roth</td><td>H869.1</td><td>Lâminas de microscópio simples para calibração de cantilever</td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio - borda fosca</td><td>Carl Roth</td><td>H870.1</td><td>Lâminas de microscópio com borda fosca para crioseccionamento</td></tr><tr><td>Agulha e oslash; 0,9 mm e vezes; 25 mm</td><td>B Braun</td><td>4657500</td><td>OCT injeção&nbsp; na amostra de pulmão</td></tr><tr><td>Agulha &oslash; 0,9 mm e vezes; 70 milímetros</td><td>B Braun</td><td>4665791</td><td>agulha longa para aplicar PBS sob o composto do OCT do AFM</td></tr><tr><td>Sakura</td><td>Finetek</td><td>4583</td><td>Tissue-Tek O.C.T.</td></tr><tr><td>Fosfato composto protegido solução salina</td><td>Bio& Venda</td><td>a solução BS.L1825</td><td>PBS sem Ca2+, Mg2+, 500 mL</td></tr><tr><td>QI Advanced Imaging Extension</td><td>Extensão do software Bruker</td><td></td><td>para o software JPK SPM que fornece para cada pixel de imagem gravada toda a curva de força subjacente.</td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>B Braun</td><td>5518083</td><td>Tesoura Cirúrgica Descartável para Bisturi</td></tr><tr><td></td><td>Kaut-Bullinger</td><td>M681700</td><td>Tesoura Precisa 13 cm&nbsp;</td></tr><tr><td>Fita de face única</td><td>tesa Film</td><td>57330-00000</td><td>fita cristalina, 33 m x 19 mm</td></tr><tr><td>Caixa de slides</td><td>GWL Storing Systems</td><td>K50W</td><td>Slidebox para 50 lâminas</td></tr><tr><td>Microscópio estéreo - Stemi DR1663</td><td>Pinças Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>- Vomm SS-SA-ESD</td><td>Eleshop</td><td>ELE002121</td><td></td></tr></tbody></table>

extraindo o módulo de young de membranas basais pulmonares murinas nativas de mapas de força derivados de microscopia de força atômica

Extracting the Young's Modulus of Native Murine Pulmonary Basement Membranes from Atomic Force Microscopy Derived Force Maps

Após a identificação e medição de uma parede alveolar intacta, o resultado primário deste protocolo são os valores filtrados do módulo de Young da MO. É importante notar que não é possível encontrar uma parede alveolar adequada para medição de AFM em todas as seções de tecido. Em nossas observações experimentais, aproximadamente 75% das criossecções derivadas de espécimes de pulmão murino exibiram uma parede alveolar quantificável. Para determinar com precisão a distribuição espacial do módulo de Young em uma MO pulmonar, aconselhamos o emprego de mapas de força abrangendo 3 μm x 3 μm ou 4 μm x 4 μm. Essa abordagem garante resolução suficiente para examinar BMs pulmonares de camundongos, que normalmente medem 100 nm - 200 nm de espessura. Portanto, a abordagem experimental envolve a captura de curvas de força 50 x 50 para cada mapa de força, resultando em um total de 2.500 curvas de força. Dentro do mapa de força, as curvas de força são espaçadas uniformemente. Isso implica que, além do módulo de Young da MO, as estruturas teciduais ao redor da MO são sondadas mesmo nos pequenos mapas de força. Portanto, para determinar com precisão e seletivamente o módulo de Young exclusivamente da MO pulmonar, implementamos um processo de filtragem em duas etapas neste protocolo.
A etapa inicial de filtragem da filtragem espacial operador-dependente seleciona os resultados de ajuste da curva de força originados da MO pulmonar murina, compreendendo aproximadamente 10% a 25% dos valores totais dos resultados contidos no mapa de força analisado. Após essa filtragem espacial inicial, aproximadamente 250 a 625 resultados de ajuste são retidos para análise posterior. A próxima etapa de filtragem garante que apenas os resultados relacionados ao BM originados de curvas de força adequadamente descritas pelo modelo de Hertz modificado sejam incluídos. Portanto, o coeficiente de determinação (R2) do ajuste do modelo Hertz modificado é usado como critério de filtro. Nossa experiência empírica sugere que manter resultados com valores de R2 superiores a 0,96 é adequado para resultados de ajuste obtidos pela adesão a esse protocolo. É importante notar que o valor R2 é significativamente influenciado pela qualidade (suavidade) e comprimento da linha de base da curva de força, pela determinação do ponto de contato e pela convergência do modelo ajustado. Após a aplicação de ambos os procedimentos de filtragem, aproximadamente 100 a 500 valores do módulo de Young normalmente permanecem para a MO de uma única parede alveolar.
A distribuição desses valores restantes do módulo de Young a partir da MO pode ser visualizada usando um histograma (Figura 4A). É importante notar que os valores do módulo de Young resultantes da MO pulmonar seguem uma distribuição log-normal, que é comumente observada para variáveis aleatórias que só podem atingir valores positivos61. Isso é visualizado pelo gráfico QQ na Figura 4B. Consequentemente, uma distribuição normal (gaussiana) pode ser ajustada à distribuição dos valores do módulo de Young (E) transformado em log. Aqui, o logaritmo natural (ln) foi usado para transformar os valores de E . A posição de pico da distribuição (μ) e o desvio padrão (σ) foram extraídos desse ajuste e posteriormente retransformados para obter o módulo de Young representativo, denotado como EBM, usando a seguinte equação:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67784/67784eq01.jpg" style="margin: auto;">
Observe que, após a retransformação, o intervalo de desvio padrão não é mais simétrico em torno do valor de pico. As arestas negativas (σ-) e positivas (σ+) do intervalo de desvio padrão podem ser calculadas usando as seguintes expressões:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67784/67784eq02.jpg" style="margin: auto;">
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/67784/67784eq03.jpg" style="margin: auto;">
Essas equações são uma consequência do fato de que a função exponencial é a função inversa do logaritmo natural62.
Após retransformar o valor de pico μ = 9,31 e o desvio padrão σ = 0,18 determinado a partir do histograma na Figura 4A, o valor representativo do módulo de Young é EBM = 11,05 kPa com um intervalo de desvio padrão de [-1,82 kPa, +2,18 kPa]. Alternativamente, uma distribuição log-normal pode ser ajustada ao histograma dos valores do módulo de Young (E) não transformados para determinar os parâmetros característicos da distribuição.
Recomenda-se que pelo menos quatro paredes por camundongo sejam analisadas para obter um resultado representativo robusto, como mostramos em detalhes em Hartmann et al.59. Para determinar o módulo de Young EBM representativo para um camundongo, os valores transformados em log de todas as quatro paredes foram plotados em um histograma combinado e μ e σ foram determinados ajustando uma distribuição normal. Posteriormente, μ e σ são retransformados conforme descrito anteriormente para recuperar EBM e o intervalo de desvio padrão para o mouse em questão.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67784/67784fig01.jpg"> 
Figura 1: Visão geral das principais etapas do protocolo para determinar o módulo de Young de uma membrana basal pulmonar murina. A etapa inicial envolve a obtenção e preparação de pulmões murinos, seguida de incorporá-los. Assim, o pulmão é injetado com uma combinação de meio OCT e PBS e, em seguida, completamente imerso no composto OCT. Em seguida, cortes de tecido pulmonar de 15 μm de espessura são obtidos por meio de crioseccionamento com criotomo. Neste protocolo, detalhamos o processo de emprego de fitas adesivas de um e dois lados para fixar as amostras no lugar durante o processo de corte. Posteriormente, os valores do módulo de Young do BM são determinados através de medições de mapa de força AFM nas seções de tecido. Após a conclusão do processo de análise da curva de força, a filtragem espacial e R² é aplicada para isolar os resultados do módulo de Young da estrutura de interesse, especificamente o BM (mostrado em verde no mapa de força e quantificado na distribuição do módulo de Young transformada em log). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67784/67784fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67784/67784fig02.jpg"> 
Figura 2: Um experimento exemplar do AFM do mapa da força conduzido em uma seção murina do tecido pulmonar. (A) Imagem da visão geral da microscopia do Brilhante-campo de uma seção murina do tecido pulmonar, permitindo a identificação de paredes alveolares intactas apropriadas situadas entre dois alvéolos. No lado direito da imagem, o cantilever triangular-dado forma F de MLCT do AFM é visível. (B) Vista ampliada de uma parede selecionada dentro da seção de tecido. (C) Inclinação e (D) canal de altura de um mapa geral de 15 x 15 μm contendo curvas de força de 50 x 50 da parede alveolar. No canal de inclinação, o MC pode ser identificado como uma linha brilhante (seta branca), indicando uma estrutura de rigidez aumentada dentro da parede. O canal de altura confirma a integridade da parede, não mostrando evidências de ruptura. Após a identificação do BM no mapa geral de 15 x 15 μm, um mapa menor de 4 x 4 μm (E: canal de inclinação, F: canal de altura) com curvas de força de 50 x 50 é registrado. Barras de escala: (A) 200 μm e (B-D) 25 μm. As escalas das cores das imagens mostradas do AFM são (C) 2,36 - 9,29 nN/μm, (D) 0 - 3,38 μm, (E) 2,36 - 9,29 nN/μm (imagem geral) e 2,42 - 8,37 nN/μm (imagem menor), (F) 0 - 3,38 μm (imagem geral) e 0 - 1,99 μm (imagem menor), de escuro a claro. Escalas de cores lineares foram usadas para todas as imagens AFM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67784/67784fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67784/67784fig03.jpg"> 
Figura 3: Visualização do procedimento de filtragem espacial. (A) O mapa do módulo de Young resultante da análise da curva de força, conforme mostrado na Ferramenta de Filtragem de Resultados para permitir a filtragem espacial dos resultados. A MO é identificável como uma faixa brilhante (altos valores do módulo de Young) cercada por compartimentos de tecido mais moles. (B) Histograma dos valores do módulo de Young correspondentes ao mapa não filtrado (A). Após a aplicação (C) da máscara de filtro espacial (área verde), (D) o histograma compreende exclusivamente os valores do módulo de Young da região destacada em verde, que foi identificada como BM. Observe que os valores suaves residuais observáveis no lado esquerdo do histograma podem ser atribuídos a ajustes mal convergentes, que serão eliminados na etapa de filtragem R² subsequente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67784/67784fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67784/67784fig04.jpg"> 
Figura 4: Distribuição do módulo de Young de uma MO pulmonar murina recebida seguindo este protocolo. (A) Histograma log-normalizado dos valores do módulo de Young da MO resultante (N = 325). Ajustando uma distribuição normal (linha sólida preta), o valor médio μ = 9,31 com um desvio padrão de σ = 0,18 é determinado. Após a retransformação, isso corresponde a um módulo de Young da MO de EBM = 11,05 kPa com um intervalo de desvio padrão assimétrico de [-1,82 kPa, +2,18 kPa]. (B) QQ Gráfico dos quantis dos valores do módulo de BM Young logaritmizados versus os quantis de uma distribuição normal padrão. Este gráfico demonstra que, com exceção de alguns valores nas caudas esquerda e direita da distribuição, os valores do módulo de Young resultantes são principalmente distribuídos log-normal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67784/67784fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Extraindo o módulo de Young de membranas basais pulmonares murinas nativas de mapas de força derivados de microscopia de força atômica

Atomic force microscopy (AFM) allows the characterization of the mechanical properties of a sample with a spatial resolution of several tens of ...

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