Aplicação de um novo hidrogel de hialuronano para cultura de folículos tridimensionais e metodologia para criopreservação de folículos ovarianos de camundongos

Esta pesquisa tem se concentrado no desenvolvimento de um sistema de cultura 3D para crescimento folicular in vitro e maturação de oócitos. A criação de tal sistema usando componentes da matriz extracelular nativa de uma célula aumentará o desenvolvimento do folículo. O maior desafio é aplicar o conhecimento de modelos animais à cultura de folículos humanos.

O acesso ao tecido ovariano humano é limitado. E os folículos humanos requerem um tempo significativamente mais longo em cultura para atingir a maturação do oócito. O modelo de cultura 3D desenvolvido neste estudo pode ser especialmente útil para a cultura de folículos ovarianos humanos, permitindo a retenção da arquitetura 3D durante o tempo prolongado necessário na cultura para a maturação do oócito.

Para começar, obtenha ovários de 10 a 14 dias de idade B6D2F1 filhotes de camundongo para o procedimento. Pipete 6 mililitros de meio de cultura folicular pré-equilibrado, ou FCM, em dois pratos de 60 milímetros e cubra com óleo mineral e incuba. Pipete 1 mililitro de colagenase para o poço central do prato e 3 mililitros de tecido ovariano, ou meio OT, no poço externo.

Mova os ovários para a solução de colagenase. No final da incubação da colagenase, mova os ovários tratados com colagenase para o poço externo para enxaguar. Troque as micropipetas e transfira os ovários para um prato fresco cheio de meio OT.

Para colher os folículos, aspire e expulse repetidamente o tecido ovariano tratado com enzimas através de pontas de pipeta cortadas em tamanhos diferentes. Provoque mecanicamente o tecido usando agulhas de calibre 27 para oito liberações de folículos. Examine sob um microscópio de dissecação com ampliação de 40x e escolha folículos pré-antrais secundários com um oócito localizado centralmente dentro de uma membrana basal intacta em uma placa OT fresca.

Coloque a placa FCM2 na incubadora por 60 minutos antes de iniciar o processo de incorporação. Faça duas gotas de 25 microlitros de gel de ácido hialurônico sem peróxido de hidrogênio na tampa para enxaguar. Mova os folículos ou aglomerados de folículos a serem incorporados da placa FCM para uma gota de hialuronano, ou gel de HA, para enxaguar sem meio de cultura.

Coloque o prato FCM de volta sob o borbulhador para gás. Para incorporar folículos, coloque 1 microlitro de gota de peróxido de hidrogênio a 0,03% na tampa de um prato de 60 milímetros. Agora, adicione 25 microlitros de 3 miligramas por mililitro de gel HA e misture.

Pipete aproximadamente oito a 10 microlitros da mistura de peróxido de hidrogênio HA em dois poços separados da placa de cultura de oito poços. E transfira rapidamente os folículos, aglomerados de folículos ou fragmentos de tecido ovariano para o centro de cada gota. Certifique-se de que não haja bolhas dentro da gota.

Após três minutos, adicione 100 microlitros de meio de cultura folicular pré-equilibrado a cada poço. Cubra com óleo mineral quente e pré-equilibrado e incube o prato. Preparar o equipamento e as soluções necessárias para o processo de vitrificação.

Posicione o suporte de RI no slot da caixa criogênica contendo nitrogênio líquido. Coloque duas gotas de solução de vitrificação pré-aquecida 1, ou VS1, lado a lado na tampa de um prato de 60 milímetros perto do topo. Agora, coloque dois folículos na primeira gota, enxágue e mova-os rapidamente para a segunda gota de VS1 para uma incubação de cinco minutos.

Enquanto os folículos incubam, faça três gotas de VS2 logo abaixo das gotas de VS1. Em seguida, mova rapidamente os folículos sequencialmente através das três gotas de VS2 em 60 segundos. Para vitrificação, pegue os folículos do VS2.

Exiba a portadora de RI no escopo de dissecação. E ajuste o foco para visualizar o pequeno orifício no bastão de plástico. Deposite folículos com o mínimo de fluido no orifício.

Coloque o bastão de plástico no canudo externo pré-resfriado. E use um selador ultrassônico para fechar o canudo. Coloque o canudo em uma taça presa à bengala criogênica.

Cubra a cana com uma capa protetora de plástico e mergulhe-a em nitrogênio líquido. Para vitrificação do transportador aberto, prepare o transportador inserindo a haste de metal CL na tampa do frasco magnetizada, garantindo uma fixação firme. Coloque um rack na caixa criogênica para conter os frascos criogênicos, garantindo que o nitrogênio líquido esteja abaixo da parte superior dos frascos.

Encha um frasco criogênico magnetizado com nitrogênio líquido e coloque no rack. Segure o suporte aberto CL pela tampa magnética anexada usando uma varinha magnética. Mergulhe o transportador CL em uma gota separada de VS2 para criar um filme crioprotetor.

Pegue todos os folículos ou aglomerados de folículos e coloque-os no filme com o mínimo de fluido. Mergulhe imediatamente o CL no frasco criogênico cheio de nitrogênio líquido para viciar a amostra. Coloque o frasco criogênico na bengala criogênica e cubra com uma manga plástica.

Mergulhe a cana em um tanque de armazenamento de nitrogênio líquido. Prepare um prato de poço central com 3 mililitros de FCM pré-equilibrado no poço externo e 1 mililitro no poço central. Depois de cobrir o meio com óleo, coloque o prato sob o borbulhador para gás.

Coloque 0,5 mililitros de soluções de aquecimento WS1 e WS2 pré-equilibradas a 37 graus Celsius em dois pratos de poço central rotulados. Mova as bengalas criogênicas com amostras do tanque de armazenamento para uma caixa criogênica cheia de nitrogênio líquido. Primeiro, remova a tampa plástica da bengala.

Em seguida, mantendo o canudo imerso, retire-o do cálice e deslize-o para dentro da ranhura de retenção na caixa criogênica. Corte o canudo externo logo acima do ponto preto. Levante o bastão de plástico interno do canudo externo e mergulhe rapidamente o bastão no WS1, girando suavemente para descarregar os folículos em 10 segundos.

Após dois minutos em WS1, use uma micropipeta para transferir folículos ou aglomerados de folículos para WS2 para uma incubação de três minutos. Em seguida, transfira-os para uma placa FCM e incube os folículos por uma a duas horas no centro bem antes de incorporar, Para aquecimento de CL portador aberto, repita a preparação da placa FCM e WS. Transfira a bengala criogênica para uma caixa criogênica e remova a tampa plástica da bengala.

Use uma varinha magnética para levantar a tampa do frasco criogênico até que a haste de metal do CL esteja visível. Segure a tampa com o suporte CL anexado usando a varinha magnética. E mergulhe rapidamente o CL no WS1, girando para descarregar os folículos em 10 segundos.

O crescimento do folículo pré-antral foi mantido na cultura tridimensional de gel de hialuronano, preservando a arquitetura do folículo nativo com um antro visível no dia 12. Os folículos encapsulados em gel de hialuronano exibiram expansão radial devido à proliferação celular da granulose, com diâmetros foliculares aumentando de cerca de 139,8 micrômetros para 385,6 micrômetros durante o período de cultivo. Oócitos ovulados em metáfase dois foram encontrados perto do folículo após o desencadeamento da gonadotrofina coriônica humana.

Os oócitos mediam aproximadamente 84,8 micrômetros de diâmetro. Com ovários frescos, tanto os folículos individuais quanto os aglomerados de folículos exibiram boas taxas de maturação. Os aglomerados foliculares de ovários criopreservados exibiram taxas de maturação mais baixas, levando à extrusão prematura de oócitos.

A criopreservação de folículos isolados foi mais eficaz do que a preservação de todo o ovário. A vitrificação folicular em ambos os portadores alcançou altas taxas de maturação, independentemente das diferenças nas taxas de resfriamento. O sistema de carreador aberto CL permitiu a criopreservação eficiente de múltiplos folículos, reduzindo o tempo de processamento.