Crioseccionamento direto de cabeças de Drosophila para coloração e imunocoloração aprimoradas de fluorescência cerebral

Nossa equipe estuda distúrbios metabólicos, cardíacos, musculares do sono e do envelhecimento usando o modelo de Drosophila. Este artigo de Jove detalhou o protocolo simplificado para o processamento do tecido cerebral, incluindo decapitação, fixação, criossecção, coloração e imagem. Meu grupo de pesquisa foi pioneiro no desenvolvimento do modelo de Drosophila para estudar várias doenças humanas e envelhecimento.

Também investigamos intervenções como alimentação com restrição de tempo e exercícios. Usamos aprendizado de máquina, ômica e abordagem molecular para estudar fatores como ritmo circadiano e genética para revelar seu impacto na integridade celular, fisiologia e comportamento. Este protocolo simplificado de pesquisa cerebral de Drosophila evita dissecções complexas, requer execução com apenas uma mão e elimina a necessidade de microscopia confocal cara, aumentando a acessibilidade e reduzindo a dependência do equipamento.

Para começar, obtenha as moscas em frascos envelhecidos, abra a válvula no tapete de dióxido de carbono e despeje rapidamente as moscas no tapete para evitar a fuga. Quando as moscas ficarem quase inconscientes, posicione-as embaixo do microscópio SZ61 movendo o tapete sob a lente objetiva. Ajuste a ampliação e o foco até que as moscas estejam claramente visíveis e confortáveis para decapitar.

Usando uma tesoura de mola, posicione as lâminas entre o tórax e a cabeça da mosca e aperte firmemente para decapitar de cinco a 10 cabeças de mosca por grupo experimental. Coloque as moscas usadas de volta em seu frasco de envelhecimento. Usando um pincel, transfira suavemente as cabeças das moscas decapitadas para tubos rotulados de 1,5 mililitro colocados no gelo.

Depois de remover os tubos do gelo, pipete 100 microlitros de paraformaldeído a 4% e PBS em cada tubo, garantindo que todas as cabeças das moscas estejam totalmente submersas. Se as cabeças aderirem às paredes do tubo, empurre-as suavemente para baixo usando uma escova ou bata levemente o tubo contra uma superfície horizontal para garantir o contato adequado com a solução. Em seguida, incube os tubos por 15 minutos em um agitador orbital em uma configuração média.

Descarte a solução de paraformaldeído e substitua-a por PBS, garantindo que todas as cabeças das moscas estejam submersas. Após a lavagem final, transfira as cabeças das moscas para uma solução de sacarose a 10% em PBS, garantindo que fiquem submersas no tubo. Encha um molde rotulado até aproximadamente 50% da capacidade com temperatura de corte ideal ou composto OCT, permitindo que ele se espalhe pelos quatro cantos do molde.

Usando um pincel, coloque cuidadosamente as cabeças fixas coletadas na superfície do composto OCT dentro do molde. Usando a ponta da pinça, empurre suavemente cada cabeça para a parte inferior do molde, garantindo que os olhos estejam orientados para baixo para um corte no plano coronal. Alinhe cuidadosamente todas as cabeças nas dimensões X, Y e Z para garantir que todas as seções contenham todos os grupos experimentais simultaneamente.

Depois de alinhar as cabeças corretamente, coloque cuidadosamente os moldes diretamente em um freezer ajustado a menos 20 graus Celsius para congelar. Depois que o molde estiver quase congelado, preencha o espaço restante com composto de OCT. Para crioseccionamento de molde, aplique uma quantidade generosa de composto OCT na parte superior do molde para prender a broca de mandril ao molde.

Coloque a broca plana em cima e deixe-a congelar completamente dentro do criostato, o que normalmente leva cinco minutos. Em seguida, solte a broca e o bloco OCT do molde. Coloque o bloco no mandril, garantindo que a orientação adequada de cima para baixo seja mantida e aperte a chave do mandril até que o bloco esteja firmemente no lugar.

Usando os botões de ajuste e os controles de profundidade do mandril, alinhe o bloco com a lâmina. Defina a largura da seção no criostato para 20 micrômetros e corte cada fatia usando um movimento lento e consistente, permitindo que o vidro anti-rolo capture cada fatia. Em seguida, capture as seções usando slides quentes tocando o slide na borda mais próxima da seção e permitindo que a seção suba no slide.

Deixe as lâminas secarem à temperatura ambiente por pelo menos 30 minutos, mas não mais de uma hora. Pegue as cabeças de mosca Drosophila criosseccionadas e use uma lâmina de barbear para remover qualquer composto OCT residual nas bordas da lâmina, deixando espaço para uma borda hidrofóbica. Em seguida, use um marcador hidrofóbico para desenhar uma borda ao redor de cada lâmina e deixe secar por cinco minutos.

Lave todas as lâminas três vezes por cinco minutos cada usando PBS, pipetando suavemente na lâmina. Depois de lavar as lâminas, pipetar 3% BSA em solução de bloqueio de solução salina tamponada com Tris nas lâminas e incubar por 30 minutos a uma hora. Em seguida, descarte a solução de bloqueio e pipete a solução de anticorpo primário nas lâminas.

Incube o anticorpo durante a noite a quatro graus Celsius ou por uma hora em temperatura ambiente usando lenços umedecidos para evitar o ressecamento. Rejeitar a solução de anticorpos primários e lavar as lâminas três vezes durante cinco minutos cada com PBS. Em seguida, adicione a solução de anticorpos secundários às lâminas e incube por uma hora em temperatura ambiente.

Depois de lavar as lâminas três vezes com PBS, deixe apenas uma pequena quantidade de PBS na lâmina. Em seguida, usando uma pipeta de 1000 microlitros, adicione três a cinco gotas de mídia de montagem endurecida contendo DAPI uniformemente na lâmina. Coloque uma lamínula na corrediça, garantindo que não se formem bolhas de ar durante a colocação.

Manuseie cuidadosamente as lâminas recém-montadas e guarde-as planas até que a mídia de montagem esteja completamente seca. Se for necessário armazenamento de longo prazo, sele as bordas das lâminas. Capture imagens das lâminas o mais rápido possível para minimizar a deterioração fluorescente.

Durante a aquisição da imagem, concentre-se em cada assunto exclusivo no mesmo canal para consistência em todos os grupos experimentais. Calibre as exposições para cada canal para evitar a superexposição em todos os canais selecionados. Certifique-se de que as exposições selecionadas permaneçam constantes e sejam apropriadas para todos os sujeitos, especialmente entre diferentes grupos experimentais.

A expressão da marca de anticorpos ApoE foi claramente localizada em regiões cerebrais de espécimes de Elav+ e Elav-ApoE4. O acúmulo de lipídios foi indicado pela coloração de vermelho Nilo, que foi visível nas regiões cerebrais em ambos os genótipos.