Name: Anisotropia de fluorescência resolvida no tempo de moléculas únicas para caracterizar a flexibilidade local em biomoléculas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-25T13:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Aprenda a usar anisotropia de fluorescência resolvida no tempo para caracterizar a flexibilidade local de biomoléculas em nível de molécula única. Este método permite observar dinâmicas proteicas como as do FoxP1.

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<table><tbody><tr><td>Filtro Centrífugo Ultra Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher Scienctific</td><td>A20100</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A20100?SID=srch-srp-A20100</td></tr><tr><td>Amicon, 10 kDa MWCO</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC901008</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/mm/ufc9010</td></tr><tr><td>Ampicilina sal de sódio</td><td>Millipore Sigma</td><td>A0166-5G</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/a0166</td></tr><tr><td>BODIP FL Maleimide (BODIPY FL N-(2-Aminoetil))Maleimida)</td><td>ThermoFisher Scienctific</td><td>B10250</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B10250?SID=srch-srp-B10250</td></tr><tr><td>Colunas de dessalinização descartáveis PD 10</td><td>Millipore Sigma</td><td>GE17-0851-01</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/ge17085101</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Millipore Sigma</td><td>10197777001</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/roche/dttro</td></tr><tr><td>DMSO,</td><td>Anidro ThermoFisher Scienctific</td><td>D12345</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/D12345?SID=srch-srp-D12345</td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Millipore Sigma</td><td>10104159001</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/roche/10104159001</td></tr><tr><td>E. coli células bacterianas C41</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Foresigh Nuvi Ni-Charged IMAC, coluna de 5 mL</td><td>Bio-Rad</td><td>12004037</td><td>https://www.bio-rad.com/en-us/sku/12004037-foresight-nuvia-ni-charged-imac-5-ml-column?ID=12004037</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millipore Sigma</td><td>7365-45-9</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/h3375</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Millipore Sigma</td><td>288-32-4</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/i5513</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Millipore Sigma</td><td>I6758-1G</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sial/i6758</td></tr><tr><td>MCE Filtro de Membrana, 0.22 &mu; m Tamanho dos poros</td><td>Millipore Sigma</td><td>GSWP02500</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/mm/gswp02500</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>7647-14-5</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/s3014</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II Sistema de Deslizamento de Câmara</td><td>ThermoFisher Scienctific</td><td>154534</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/154534</td></tr><tr><td>OverExpress C41 (DE3) Quimicamente Células Competentes</td><td>Millipore Sigma</td><td>CMC0017-20X40UL</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/cmc0017</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Millipore Sigma</td><td>329-98-6</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/78830</td></tr><tr><td>Rodamina 110</td><td>ThermoFisher Scienctific</td><td>419075000</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/419075000?SID=srch-hj-419075000</td></tr><tr><td>Sódio fosfato dibásico</td><td>Millipore Sigma</td><td>7558-79-4</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/s3264</td></tr><tr><td>Fosfato de sódio monobásico di-hidratado</td><td>Millipore Sigma</td><td>13472-35-0</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/71505</td></tr><tr><td>TCEP, cloridrato, grau de reagente</td><td>Millipore Sigma</td><td>580567-5GM</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/mm/580567</td></tr><tr><td>Interpolação 20</td><td>milipore Sigma</td><td>11332465001</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/roche/11332465001</td></tr></tbody></table>

anisotropia de fluorescência resolvida no tempo de moléculas únicas para caracterizar a flexibilidade local em biomoléculas

Time-Resolved Fluorescence Anisotropy from Single Molecules for Characterizing Local Flexibility in Biomolecules

A anisotropia de fluorescência surge da orientação relativa da absorção do fluoróforo e dos momentos de dipolo de emissão. Quando os fluoróforos são expostos à luz polarizada, os fluoróforos com momentos de transição de absorção alinhados com o vetor do campo elétrico da luz incidente são preferencialmente excitados (fotosseleção). Consequentemente, a população do estado excitado torna-se parcialmente orientada, com uma fração significativa das moléculas excitadas tendo seus momentos de transição alinhados com o vetor do campo elétrico da luz excitante polarizada61. Os fluoróforos giram devido ao seu movimento browniano. Assim, o momento de transição de emissão também gira, resultando em dependência de tempo na anisotropia de fluorescência. Esse efeito pode ser usado para medir os movimentos rotacionais de moléculas fluorescentes, detectar eventos de ligação, caracterizar o ambiente do fluoróforo e capturar a dinâmica molecular.
Experimentos de molécula única são posicionados de forma única para determinar a heterogeneidade da amostra. Aproveitar a sensibilidade de uma única molécula e a anisotropia de fluorescência adiciona outra dimensionalidade à espectroscopia de fluorescência multiparâmetro. Em um microscópio confocal típico de molécula única (Figura 2) 20 , 21 , a anisotropia de fluorescência pode ser determinada por meio de intensidade ou resolvida no tempo quando lasers pulsados são usados.
Para considerar os efeitos despolarizantes da objetiva de alta abertura numérica em um microscópio confocal62, a forma adequada da anisotropia resolvida no tempo35,63 é dada por
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq01.jpg" style="margin: auto;">(1)
onde <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq02.jpg" style="margin: auto;"> e <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq03.jpg" style="margin: auto;"> são a intensidade de fluorescência resolvida no tempo no canal de detecção y-ésimo após excitação no comprimento de onda x, para a polarização paralela e perpendicular l1 e l2 e são fatores que descrevem a mistura entre os sinais paralelos e perpendiculares devido à alta abertura numérica (NA) objetiva usada nessas medições35,62, 64. As diferenças nas eficiências de detecção do canal de detecção paralelo, <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq04.jpg" style="margin: auto;">, e perpendicular, <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq05.jpg" style="margin: auto;">, para o corante são corrigidas com a razão das eficiências de detecção, <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq06.jpg" style="margin: auto;">. O G UV também é conhecido como fator G.
A anisotropia de fluorescência resolvida no tempo pode ser modelada usando um decaimento multiexponencial para explicar o fluoróforo sendo ligado a uma biomolécula maior como
<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq07.jpg" style="margin: auto;">,     (2)
onde r0 é a anisotropia fundamental dependente do fluoróforo (tipicamente r0 = 0,38), r∞ é a anisotropia residual e ρ1 e ρ2 são tempos de correlação rotacional rápidos (movimentos locais do fluoróforo) e lentos (movimento global da macromolécula), respectivamente.
Nas medições de anisotropia de molécula única (Figura 2), os tempos de chegada dos fótons são registrados para identificar emissores individuais usando a análise de tempo de vida de fluorescência integrada à explosão (BIFL)33,35. Os tempos de chegada entre fótons (Δt) são suavizados usando uma média móvel e, em seguida, plotados para ajudar na visualização. O histograma desses tempos é equipado com um meio gaussiano para determinar a média e o desvio padrão dos fótons originados do fundo. Um limite arbitrário, definido em múltiplos do desvio padrão, é usado para filtrar eventos individuais enquanto identifica o primeiro e o último fóton em cada rajada. Os fótons dentro de cada explosão são então integrados para análise posterior, que inclui o cálculo da anisotropia de fluorescência em estado estacionário resolvida no tempo e baseada em intensidade usando as equações 1 e 2 ou por meio de um estimador de máxima verossimilhança35. Devido ao número limitado de fótons em eventos de molécula única, o estimador de máxima verossimilhança considera apenas um único componente exponencial e não será discutido mais adiante.
Em um histograma bidimensional de eventos de molécula única, o tempo médio de vida de fluorescência (τ) e a anisotropia (rxy) podem ser relacionados pela equação de Perrin29,61 para obter (ρ) como um tempo médio de rotação.
<img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq08.jpg" style="margin: auto;">(3)
Valores específicos de ρ podem ser obtidos com maior certeza por análise de "subconjunto" (se), onde os fótons de diferentes rajadas são integrados em um decaimento combinado de anisotropia de fluorescência resolvido no tempo que pode ser analisado otimizando os parâmetros da equação 2 para o decaimento experimental (seTRFA). A anisotropia resolvida no tempo pode resolver a heterogeneidade e a dinâmica associadas aos movimentos rotacionais (locais e globais) das biomoléculas dentro da emissão de fluorescência que ocorre dentro do período de tempo ns.
Para detectar a dinâmica dentro de eventos de molécula única (na escala de submilissegundos), introduzimos a Análise de Variância de Explosão de anisotropia resolvida no tempo (traBVA) 57 . Em traBVA, para uma explosão de fótons contendo Mi segmentos de fótons consecutivos, a variância de anisotropia excessiva (s2) para rajadas é
<img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq09.jpg" style="margin: auto;">.     (4)
Para um único estado anisotrópico, a variância σ2 surge apenas do ruído de disparo65 (sn: √N, onde N é o número de fótons)
<img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq10.jpg" style="margin: auto;">(5)
onde m é o número de fótons em uma explosão. Portanto, para identificar variância adicional na anisotropia, podemos definir o excesso de variância de anisotropia (S2) devido à heterogeneidade conformacional como a diferença entre as equações 4 e 5.
<img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq11.jpg" style="margin: auto;">(6)
Para capturar a dinâmica que ocorre na observação de moléculas individuais e considerar a aproximação da variância, a Análise de Distribuição de Fótons de anisotropia dinâmica (daPDA) 55 , 56 pode ser usada . Em daPDA, a intensidade de fluorescência é modelada seguindo uma probabilidade condicional (<img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq12.jpg" style="margin: auto;">) expressa como uma distribuição binomial.
<img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq13.jpg" style="margin: auto;">(7)
Juntos, com uma estimativa da taxa de contagem de antecedentes que segue uma distribuição de Poisson
<img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq14.jpg" style="margin: auto;">(8)
onde <img alt="Equation 15" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq15.jpg" style="margin: auto;"> é o número médio de fótons de fundo por janela de tempo definida. As contagens de fundo paralelas e perpendiculares <img alt="Equation 16" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq16.jpg" style="margin: auto;"> e <img alt="Equation 17" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq17.jpg" style="margin: auto;">, podem ser medidas usando amostras de buffer como referência. A anisotropia de fluorescência determinada experimentalmente é otimizada minimizando uma figura de mérito χ2 com uma distribuição de intensidade de fluorescência por canal de polarização que pode incluir mudanças cinéticas.
As rotinas de análise e representações de dados fornecidas oferecem uma abordagem abrangente para interpretar os dados coletados. Embora este protocolo se concentre principalmente em medições confocais, que são limitadas na captura de mudanças de anisotropia de nanossegundos a milissegundos, é possível adotar um microscópio de reflexão interna total para monitorar a anisotropia de fluorescência em escalas de tempo mais longas, permitindo a análise de séries temporais66. Para medições confocais de molécula única, destacamos o uso de histogramas multidimensionais que criam uma impressão digital única do conjunto observado. Os decaimentos de fluorescência resolvidos no tempo, reconstruídos a partir de populações selecionadas, podem rastrear a evolução da anisotropia de fluorescência na escala de nanossegundos (Figura 3). A análise de distribuição de fótons55,56 e a análise de variância de explosão (BVA)57,58 também podem capturar a dinâmica em escalas de tempo intermediárias entre decaimentos resolvidos no tempo e histogramas multidimensionais. Embora este protocolo não cubra o uso de espectroscopia de correlação de fluorescência de polarização (FCS), com ou sem excitação pulsada67,68, que pode fazer a ponte entre as escalas de tempo de nanossegundos a milissegundos, os mesmos dados podem ser usados para calcular o FCS69, embora isso esteja fora do escopo do protocolo apresentado. Se tais experimentos forem realizados, recomenda-se um tempo de medição de amostra mais longo.
Essa abordagem foi aplicada a um sistema complexo como as proteínas FoxP humanas, fornecendo informações valiosas sobre os movimentos envolvidos em seu mecanismo de ação. As proteínas FoxP são fatores de transcrição envolvidos em vários aspectos fisiológicos, como desenvolvimento cerebral e pulmonar; É importante ressaltar que diferentes mutações foram reconhecidas como prejudicando a função dessas proteínas 70,71. Usando o domínio de ligação ao DNA de FoxP1 como modelo, geramos diferentes mutantes de cisteína única para introduzir um corante BODIPY-FL como rastreador de movimentos ( Figura 4A ). De fato, avaliamos o efeito da dimerização e da ligação ao DNA como principais reguladores estruturais dessa proteína. Usando a abordagem smFA, geramos gráficos 2D-smFA e fizemos traBVA e daPDA para cada mutante em condições monoméricas e diméricas. Mostramos um exemplo de um dos mutantes individuais estudados (Figura 4). O comportamento da anisotropia é semelhante em todos os mutantes em termos de determinação de tempos de correlação rotacional altos e baixos e, portanto, conjuntos presumíveis, desordenados e dobrados. Ainda assim, também é altamente heterogêneo em todos os mutantes em termos de fração e cinética de cada conjunto, evidenciando diferentes mudanças de transição ordem-desordem influenciadas pela dimerização e pela ligação ao DNA, e mostra a descrição em alta resolução da dinâmica estrutural ao longo da cadeia (Figura 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67802/67802fig01.jpg"> 
Figura 1: Faixa dinâmica de biomoléculas e métodos de anisotropia de fluorescência. (A) A anisotropia de pequenos fluoróforos amarrados a várias posições ao longo da espinha dorsal da biomolécula de interesse informa a dinâmica estrutural local. (B) Escalas de tempo sondadas por decaimentos de intensidade de fluorescência (anisotropia de fluorescência resolvida no tempo, FA) e histogramas de molécula única de dados de microscópio confocal de molécula única. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67802/67802fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67802/67802fig02.jpg"> 
Figura 2: Registro e processamento de dados de anisotropia de fluorescência de molécula única. (A) As moléculas de difusão livre são analisadas usando um microscópio confocal de molécula única equipado com um único laser de excitação polarizado linearmente (azul em nosso caso). A emissão de fluorescência (verde no nosso caso) é detectada por dois detectores depois que um polarizador de feixe divide o sinal em duas polarizações (paralela <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq18.jpg" style="margin: auto;">e perpendicular <img alt="Equation 19" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq19.jpg" style="margin: auto;">à fonte de excitação). (B) Cada fóton detectado é caracterizado por três parâmetros: tempo micro, tempo macro e tipo de canal. Os dados são armazenados em um formato TTTR (Time-Tagged Time-Resolved (TTTR)72. (C) Explosões de moléculas individuais são selecionadas e processadas para extrair parâmetros de fluorescência, incluindo anisotropia de fluorescência para cada molécula observada. (D) Os dados são representados de várias maneiras, incluindo gráficos bidimensionais de anisotropia de fluorescência versus tempo de vida de fluorescência e decaimentos de anisotropia resolvidos no tempo. Essas representações permitem a determinação visual e quantitativa do tempo de vida da fluorescência, tempos de correlação rotacional e heterogeneidade do sistema. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67802/67802fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67802/67802fig03.jpg"> 
Figura 3: Dados representativos para dímero trocado de domínio FoxP1. (A) Correlação da anisotropia de fluorescência (dispersão r) com o tempo de vida médio de fluorescência por molécula como um gráfico de contorno. Sobreposição de uma única equação de Perrin para dois componentes rotacionais como representante da média do conjunto da molécula, considerando ρ1 e ρ2 de 0,2 ns e 8,5 ns, respectivamente. (B) Os decaimentos de fluorescência resolvidos no tempo do subconjunto são usados para calcular a anisotropia de fluorescência resolvida no tempo da amostra. O ajuste à equação 2 resolveu os componentes locais e globais da anisotropia de fluorescência. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67802/67802fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67802/67802fig04.jpg"> 
Figura 4: Dinâmica de FoxP1 em submilissegundos monitorada usando anisotropia de fluorescência de molécula única (smFA). (A) Uma representação de desenho animado da estrutura monomérica de FoxP1. (B) Um histograma bidimensional ilustra a heterogeneidade dinâmica, revelando dois tempos de correlação rotacional distintos identificados por meio da anisotropia de fluorescência resolvida no tempo. A Análise de Variância de Explosão de anisotropia resolvida no tempo (traBVA) revela um pequeno subconjunto de eventos com excesso de variância (Eq. 6) que exibem grande anisotropia. A análise quantitativa de anisotropia dinâmica usando a Análise de Distribuição de Fótons (PDA) extrai ainda mais as taxas de câmbio para este processo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67802/67802fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67802/67802fig05.jpg"> 
Figura 5: Triagem dos movimentos locais e globais de FoxP1 durante a dimerização. (A) Uma representação de desenho animado compara o FoxP1 monomérico com sua forma dimérica. (B) A variância média do excesso por local em condições monoméricas e diméricas é mostrada, com maior variância excessiva indicando mudanças mais significativas na anisotropia. (C) A análise dinâmica de anisotropia usando a Análise de Distribuição de Fótons (PDA) ajuda a determinar frações populacionais (alta anisotropia em cores escuras e baixa anisotropia em cores claras) na ausência (verde) e presença (amarelo) de DNA. Nessa abordagem, foram estimadas taxas (não mostradas) para transições entre comportamentos locais e globais, revelando que o FoxP1 sofre desdobramento parcial. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67802/67802fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Anisotropia de fluorescência resolvida no tempo de moléculas únicas para caracterizar a flexibilidade local em biomoléculas

We describe a protocol for conducting time-resolved fluorescence anisotropy at the single-molecule level using confocal microscopy to investigate the ...

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Biochemistry

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