Anisotropia de fluorescência resolvida no tempo de moléculas únicas para caracterizar a flexibilidade local em biomoléculas

Esta pesquisa tem como objetivo estudar a flexibilidade local e a dinâmica de biomoléculas no nível de molécula única, usando anisotropia de fluorescência resolvida no tempo no modo de microscopia confocal. A detecção e localização de uma única molécula permitiram a observação de biomoléculas, mas a captura de sua dinâmica requer outras abordagens. Os métodos de fluorescência resolvidos no tempo ajudam a preencher essa lacuna.

Ferramentas comuns para estudar experimentalmente a dinâmica biomolecular, incluindo traste de molécula única e RMN. No nível de molécula única, várias análises, processos, emissão fluorescente de fóton por fóton, incluem análise resolvida no tempo e análise de variância de explosão.

O uso de vários fluoróforos para experimentos de smFRET pode introduzir complexidades no projeto experimental e na fabricação de amostras de qualidade suficiente. O uso de um único rótulo e anisotropia de fluorescência resolve algumas dessas complexidades.

Descobrimos que a forma monomérica do domínio forkhead do FoxP1 humano se comporta como uma proteína desordenada e aumenta sua população de dobramento quando dimeriza.

[Instrutor] Para começar, filtre a solução tampão padrão preparada através de um filtro de tamanho de poro de 0,22 micrômetro. Em seguida, filtre o tampão padrão através de um filtro de carvão para aquisição de molécula única. Para as sondas fluorescentes, prepare alíquotas de pequeno volume do BODIPY Fluorescent Pro preparado. Para calibração da configuração resolvida por polarização, primeiro ligue os canais do detector paralelo e perpendicular e ligue o laser azul. Certifique-se de que a potência do laser esteja definida para 60 microwatts e abra a contagem de fótons únicos correlacionada ao tempo ou o painel de controle do software TCSPC. Em seguida, misture um microlitro de 100 nanomolares de Rodamina 110 com 49 microlitros de água destilada. Adicione uma gota de líquido de imersão em cima da lente objetiva do microscópio. Coloque a lamínula na objetiva do microscópio e certifique-se de que a gota de água esteja centralizada na lente. Adicione 50 microlitros da solução diluída de rodamina 110 ao centro da lamínula para medições de calibração. Ajuste o plano da imagem para ficar dentro da solução e acima da superfície do vidro. Usando o botão de foco, localize o segundo ponto focal brilhante e ajuste-o para 1 1/2 voltas. Agora abra o software no modo Time-Tagged Time-Resolved e clique no botão START. Registre a taxa de contagem por 120 segundos. Para medições de fundo, adicione 50 microlitros de água destilada ao centro da lamínula e repita a aquisição. Registre a taxa de contagem de fótons por 300 segundos e salve o arquivo como water.ptu. Para medições adicionais de fundo, adicione 50 microlitros de tampão padrão ao centro da lamínula. Registre a taxa de contagem de fótons por 300 segundos e salve o arquivo como standard_buffer.ptu. Agora inicie o software de análise Burst Integration Fluorescence Lifetime, BIFL, e clique em Confirmar a configuração na janela automática. Em seguida, clique em Obter parâmetros do arquivo e, em seguida, clique em OK. Para selecionar a medida a ser analisada, clique em Data Path Array e selecione o conjunto de dados apropriado. Agora carregue o arquivo water.ptu de medição de água para matrizes, como Green Scatter, o arquivo standard_buffer.ptu para o fundo verde e Rhodamine110.ptu para Green thick. nos parâmetros de seleção de Molécula única, clique em Avançar e em Ajustar para abrir uma nova janela pop-up. Em seguida, pressione Limiar para modificar o tempo de chegada do interfóton e escolha o tempo de evento de molécula única para o tempo médio de chegada do interfóton. Agora clique no número mínimo para definir o número mínimo de fótons por evento de molécula única. Em seguida, feche a janela pop-up clicando em Return e OK. Clique nos parâmetros Color Fit para ajustar o tempo de vida inicial da fluorescência para verde e outras cores usando parâmetros de decaimento de fluorescência. Modifique, solicite e atrase os valores ajustando os valores de de e para e feche a janela pop-up. Por fim, pressione Salvar para processar os arquivos ASCII e salvá-los na pasta selecionada. Transferir um pré-inóculo de Escherichia coli C41 durante a noite para 500 mililitros de meio LB com antibiótico pré-adicionado a uma proporção de diluição de 1:500. Meça a absorbância da cultura a 600 nanômetros para monitorar o crescimento da cultura. Quando a densidade óptica atingir entre 0,5 e 0,7, adicione IPTG a uma concentração final de 0,5 milimolar para induzir a expressão da proteína e incube. Centrifugue as células bacterianas a 3.000 g por 20 minutos a quatro graus Celsius quando a cultura atingir uma densidade óptica de 1,4 a 1,6. Depois de descartar o sobrenadante, armazene o pellet a menos 20 graus Celsius até o uso. Em seguida, adicione 50 a 100 proteínas FoxP1 micromolares a um excesso molar dez vezes maior de DTT ou TCEP e incube. Coloque uma coluna de dessalinização PD-10 em um tubo de centrífuga de 50 mililitros usando um adaptador de coluna para troca de tampão. Adicione cinco mililitros de tampão PBS à coluna para equilíbrio e centrifugue a 1.000 g por dois minutos. Transfira a coluna PD-10 para um novo tubo de 50 mililitros e adicione dois mililitros de tampão PBS na coluna. Agora carregue 500 microlitros de proteína FoxP1 na coluna. Eluir a coluna centrifugando a 1.000 g durante dois minutos para recolher a proteína purificada. Transfira a proteína para um filtro ultracentrífugo de corte de peso molecular de 10 kilodaltons. Após centrifugação a 7.500 g durante 10 minutos, recolher o eluído concentrado. Meça a concentração de proteína. Em seguida, adicione BODIPY e incube a quatro graus Celsius por duas horas em um rotador. Repita a troca de tampão e a concentração de proteína. Depois de determinar a concentração de proteína, meça o grau de marcação usando a fórmula. Adicione 495 microlitros de água ultrapura e cinco microlitros de Tween 20 em um poço de uma lâmina de câmara e misture bem. Após uma incubação de 30 minutos à temperatura ambiente, lave a câmara suavemente com água ultrapura duas vezes e seque-a. Para corrigir a fluorescência de fundo, faça medições de uma solução tampão. Calibre a sensibilidade relativa dos detectores paralelos e perpendiculares adquirindo dados de um corante de rotação rápida Para experimentos de anisotropia de fluorescência de molécula única em FoxP1 monomérico, adicione 100 BODIPY picomolar marcado com FoxP1 e 100 nano molar não marcado FoxP1 a 500 microlitros de tampão padrão em uma lâmina de câmara. Inicie as medições e verifique no software BIFL se o número de rajadas registradas em 30 segundos está entre 60 e 90. Se a amostra estiver mais concentrada, dilua-a até que a contagem de intermitências caia dentro desse intervalo. Por fim, analise as medições. A análise do tempo de vida da anisotropia de fluorescência de molécula única revelou uma única distribuição originada de dois tempos de correlação rotacional distintos no domínio de ligação ao DNA FoxP1, sugerindo a coexistência de conjuntos estruturais ordenados e desordenados. A análise de variância de explosão identificou um subconjunto de moléculas de FoxP1 exibindo alta anisotropia e variantes excessivas, sugerindo a presença de mudanças conformacionais dinâmicas. A análise da distribuição de fótons diferenciou entre estados FoxP1 monoméricos e diméricos, mostrando distribuições de anisotropia e taxas de troca distintas. A dimerização influenciou os movimentos locais e globais em FoxP1 com medições de variância excessiva indicando alterações anisotrópicas significativas em locais específicos marcados com cisteína. A análise dinâmica de anisotropia revelou que FoxP1 sofre desdobramento parcial após dimerização e ligação ao DNA, alterando a fração de populações estruturadas e desordenadas.