O Isolamento e Caracterização de Neutrófilos de Baixa e Densidade Normal do Sangue Total

Nossa pesquisa visa entender o papel dos subconjuntos de neutrófilos e como eles contribuem para a patogênese de doenças inflamatórias como o lúpus. Em um sentido mais amplo, nosso trabalho também demonstra a heterogeneidade das populações de neutrófilos na biologia humana e como isso pode mudar com base em estados fisiológicos variados. Pesquisas emergentes mostram que as populações de neutrófilos em humanos são heterogêneas.

No entanto, os neutrófilos continuam a ser estudados como uma única população devido à dificuldade em isolar subtipos de forma confiável sem ativação e em quantidade suficiente. Nosso protocolo fornece um método para isolamento intocado e caracterização básica de subtipos de neutrófilos, superando esses problemas. Pesquisas recentes, embora limitadas, mostraram que os subtipos de neutrófilos, como os neutrófilos de baixa densidade, desempenham um papel em estados fisiológicos alterados, como gravidez e inflamação, bem como em doenças como tuberculose, autoimunidade e câncer.

Nosso protocolo permitirá pesquisas reprodutíveis e robustas sobre as contribuições dessas células para a saúde e doenças humanas. Agora que temos um protocolo robusto testado para separar neutrófilos de baixa densidade de neutrófilos de densidade normal, estamos nos concentrando em responder a perguntas básicas sobre como esses neutrófilos de baixa densidade se apresentam em condições inflamatórias. Estamos especialmente interessados em como eles são diferentes dos neutrófilos de densidade normal em seus números de células, fenótipo imunológico, imunometabolismo e muito mais.

Para começar, rotule quatro tubos cônicos de 50 mililitros para soluções de trabalho isotônicas de 100%81%70%e 55%Adicione 27 mililitros de meio gradiente de densidade ao primeiro tubo rotulado como 100%Adicione 3 mililitros de 10X PBS. Em seguida, meça os volumes necessários de soluções isotônicas 100% de trabalho e 1X PBS para cada concentração das soluções de trabalho. Adicione-o aos respectivos tubos cônicos.

Use uma pipeta Pasteur para misturar bem para homogeneidade. Agora coloque cuidadosamente 3 mililitros da solução isotônica de trabalho a 81% na parte inferior de um tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, lenta e suavemente, coloque 3 mililitros da solução isotônica de trabalho a 70% por cima, garantindo que as camadas não se misturem.

Para preparar o tampão de separação celular, combine soro bovino fetal 2%, EDTA 1 milimol e PBS para um volume total de 500 mililitros. Pipete para misturar bem para uniformidade. Vortex as esferas magnéticas completamente por 30 segundos para garantir que sejam totalmente ressuspensas antes do uso.

Para cada doador, alíquota de 4 mililitros de sangue total em três tubos de fundo redondos separados de 14 mililitros. Pipete 200 microlitros de coquetel de isolamento de neutrófilos e 200 microlitros de esferas magnéticas em cada tubo. Pipete suavemente a solução para ressuspender a mistura antes de incubar para permitir que os reagentes se liguem às células indesejadas.

Em seguida, adicione o tampão de separação de células a cada tubo para completar o volume de 12 mililitros e misture bem. Coloque os tubos sem tampas em um rack magnético e incuba. Agora use uma pipeta sorológica para transferir cuidadosamente a suspensão de células claras contendo neutrófilos de cada tubo para um novo tubo limpo.

Em seguida, remova o tubo original do ímã. Vortex as contas magnéticas novamente por 30 segundos. Adicione 200 microlitros de esferas magnéticas à suspensão de células recém-transferidas antes da ressuspensão e incubação, conforme demonstrado anteriormente.

Coloque os tubos de volta no ímã sem tampas. Após uma incubação de 10 minutos à temperatura ambiente, transfira a suspensão de células claras contendo neutrófilos isolados para um novo tubo. Puxe as suspensões isoladas de neutrófilos obtidas de sangue total em um único tubo de 50 mililitros.

Encha o tubo até um volume total de 50 mililitros usando o tampão de separação de células. Centrifugue com a quebra ligada, descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet de neutrófilos em 1 mililitro de tampão de separação celular. Depois de centrifugar novamente a suspensão, rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de neutrófilos em 3 mililitros do meio de gradiente de densidade de 55%.

Coloque lentamente os 3 mililitros de meio de gradiente de densidade de 55% contendo a suspensão celular nos tubos de gradiente de densidade pré-fabricados, evitando perturbações do gradiente. Centrifugar os tubos a 720 G durante 30 minutos sem utilizar o intervalo. Após a centrifugação, manuseie os tubos com cuidado para evitar perturbar as camadas.

Com uma pipeta de transferência, isole cuidadosamente as camadas separadas contendo neutrófilos de densidade baixa e normal e transfira-as para tubos separados de 15 mililitros marcados. Para lavar qualquer meio de gradiente de densidade residual, adicione PBS a cada tubo de 15 mililitros até a marca de 15 mililitros. Em seguida, centrifugue a 400 G por 5 minutos em temperatura ambiente com a ruptura ligada.

Conte as células em cada fração em um hemocitômetro antes de mais experimentos. A estratificação de neutrófilos totais sobre o meio gradiente de densidade resultou na formação bem-sucedida de duas bandas distintas. Com os neutrófilos de baixa densidade formando uma banda superior e os neutrófilos de densidade normal formando uma banda inferior.

A sobrecarga do meio de gradiente de densidade com neutrófilos acima de 5-6 milhões de células por mililitro fez com que as bandas parecessem difusas, aumentando o risco de mistura de subtipos. A pureza média de isolamento foi de 93,8% para neutrófilos de baixa densidade e 96,3% para neutrófilos de densidade normal com contaminação mínima de outros tipos de células.