Ajuste fino da orientação de Caenorhabditis elegans em almofadas de ágar canalizadas para neuroregeneração de imagem

O foco principal do nosso laboratório é definir os mecanismos subjacentes à regeneração do sistema nervoso central de mamíferos usando o organismo modelo, C.elegans. Estudamos a regeneração em vários neurônios e buscamos a identidade do sinal de pré-condicionamento que leva à regeneração aprimorada do sistema nervoso central. Os desafios experimentais atuais incluem a introdução de bolhas de ar durante a substituição da placa de vidro no disco de vinil e a obtenção de uma espessura uniforme do molde.

No entanto, uma vez criado o molde PDMS, ele pode ser reutilizado para mandíbulas. A lacuna de pesquisa que estamos abordando é o controle limitado sobre a orientação de animais adultos. Os animais adultos são maiores em diâmetro e são mais pigmentados, causando problemas de imagem em planos Z mais profundos.

Além disso, a introdução da lamínula também altera a orientação inicial. Os canais ajudam a manter a orientação dos animais na introdução da lamínula, permitindo que as células-alvo fiquem mais próximas do objetivo para a imagem. Os canais também reduzem o estresse nos animais, promovendo a fisiologia normal, incentivando a configuração linear dos animais e criando consistência ao obter imagens em vários animais.

Para começar, despeje uma proporção de 1 para 10 do agente de cura rápida na base em um prato de pesagem descartável. Misture bem o líquido não curado por 45 segundos até que esteja totalmente integrado e cheio de bolhas. Em seguida, coloque a bandeja contendo a mistura PDMS não curada em um dessecador a vácuo inclinado.

Alterne a pressão entre menos 0,09 quilo pascal e menos 0,1 quilo pascal três vezes para permitir que as bolhas de ar apareçam. Enxágue bem o disco de vinil e a placa de vidro com água deionizada e deixe o disco de vinil secar completamente antes de usá-lo novamente. Coloque uma folha de papel alumínio em cima da placa de aquecimento para coletar qualquer excesso de PDMS.

Em seguida, coloque uma lâmina de vidro em cada extremidade do disco de vinil para definir a espessura do molde, garantindo uma altura uniforme ao pressionar o painel de vidro no PDMS não curado. Agora, despeje o líquido PDMS não curado em um lado do disco de vinil. Incline a placa de vidro e abaixe-a lentamente para permitir que o ar preso escape.

Em seguida, catalise o PDMS a 100 graus Celsius por 20 minutos. Retire o disco de vinil da placa quente e deixe esfriar. Depois disso, retire cuidadosamente o PDMS do disco de vinil para evitar rasgos.

Em seguida, retire o PDMS do painel de vidro. Usando uma nova lâmina de vidro como guia, corte o PDMS com uma navalha afiada para criar um molde de ágar canalizado. Descasque o excesso de PDMS para mostrar o molde de ágar canalizado cortado final.

Adicione 0,6 gramas de ágar e 30 mililitros de estoque líquido de meio de crescimento de nematóides em um frasco. Coloque uma barra de agitação no frasco e aqueça a mistura em uma placa quente, ajustada para 120 graus Celsius. Adicione 120 microlitros de solução estoque de azida de sódio após o gel derreter.

Em seguida, lave bem o molde PDMS com água e deixe secar ao ar. Coloque o molde PDMS entre dois conjuntos de pares de lâminas para prepará-lo para uso. Usando uma pipeta, puxe a solução de ágar para cima e para baixo para aquecer a ponta da pipeta e pipete 300 microlitros de ágar derretido no molde PDMS.

Por fim, coloque uma lâmina de microscópio diretamente no ágar, garantindo que ela fique apoiada nas lâminas nas laterais. Remova a lâmina depois que o ágar-ágar esfriar completamente. As almofadas de ágar canalizadas facilitaram a orientação precisa de Caenorhabditis elegans, rolando o animal para alinhar pontos de referência, como a vulva e o intestino em forma de S, verificados sob um microscópio de dissecação fluorescente antes de transferir para um microscópio invertido.

A imagem fluorescente verificou a orientação adequada de Caenorhabditis elegans nas almofadas de ágar canalizadas, conforme mostrado em micrografias fluorescentes. As almofadas de ágar canalizadas melhoraram a qualidade da imagem para a regeneração neuronal, posicionando as fibras dos neurônios regenerados mais próximas da lente objetiva, minimizando a dispersão e a absorção de luz.