Name: Ajuste fino da orientação de Caenorhabditis elegans em almofadas de ágar canalizadas para neuroregeneração de imagem (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-31T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: Aprenda a criar almofadas de ágar canalizadas usando moldes de PDMS para orientar Caenorhabditis elegans em estudos de neuroregeneração. Este método melhora a qualidade da imagem e facilita a análise de estruturas neuronais.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Fabricação de almofadas de ágar canalizadas usando moldes PDMS para controlar a orientação animal

<ol><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li>
<li>Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+killing+of+cells+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biol. 48, 225-250 (1995).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+self-regulating+feed-forward+circuit+controlling+C-elegans+egg-laying+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">A self-regulating feed-forward circuit controlling C-elegans egg-laying behavior.</a> Curr Biol. 18 (19), 1445-1455 (2008).</li>
<li>Chung, S. H., Mazur, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtosecond+laser+ablation+of+neurons+in+C.+elegans+for+behavioral+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Phys+A-Mater+Sci+Process%22%5BJournal%5D)">Femtosecond laser ablation of neurons in C. elegans for behavioral studies.</a> Appl Phys A-Mater Sci Process. 96 (2), 335-341 (2009).</li>
<li>Zellag, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CentTracker%3A+a+trainable%2C+machine-learning-based+tool+for+large-scale+analyses+of+Caenorhabditis+elegans+germline+stem+cell+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">CentTracker: a trainable, machine-learning-based tool for large-scale analyses of Caenorhabditis elegans germline stem cell mitosis.</a> Mol Biol Cell. 32 (9), 915-930 (2021).</li>
<li>Huang, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+neuron+in+C.+elegans+orchestrates+multiple+motor+outputs+through+parallel+modes+of+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">A single neuron in C. elegans orchestrates multiple motor outputs through parallel modes of transmission.</a> Curr Biol. 33 (20), 4430-4445.e6 (2023).</li>
<li>Rasmussen, N. R., Dickinson, D. J., Reiner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ras-dependent+cell+fate+decisions+are+reinforced+by+the+RAP-1+small+GTPase+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Ras-dependent cell fate decisions are reinforced by the RAP-1 small GTPase in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 210 (4), 1339-1354 (2018).</li>
<li>Rivera Gomez, K., Schvarzstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+nematodes+for+live+imaging+using+an+agarose+pad+produced+with+a+vinyl+record%5BTitle%5D)+AND+%22MicroPubl+Biol%22%5BJournal%5D)">Immobilization of nematodes for live imaging using an agarose pad produced with a vinyl record.</a> MicroPubl Biol. 2018, (2018).</li>
<li>Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+AFD+neuron+in+C.+elegans+thermotaxis+analyzed+using+femtosecond+laser+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation.</a> BMC Neuroscience. 7 (1), 30(2006).</li>
<li>Gerhold Abigail, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+the+regulation+of+stem+and+progenitor+cell+mitotic+progression+by+in+situ+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Investigating the regulation of stem and progenitor cell mitotic progression by in situ imaging.</a> Curr Biol. 25 (9), 1123-1134 (2015).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Cantil Erlenmeyer de 125 mL</td><td>Corning</td><td>4980-125</td><td></td></tr><tr><td>33 1/2 RPM ou 12 polegadas de reprodução longa (LP) disco de vinil&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Profundidade do canal individual: 50 &micro; m, largura: 200 &micro; m</td></tr><tr><td>Seringa de plástico de 30 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-793-817</td><td></td></tr><tr><td>90% Platina, 10% Fio de Irídio</td><td>Tritech Research&nbsp;</td><td>PT-9010</td><td>usado para criar</td></tr><tr><td>folha de alumínio</td> de platina<td>Amazon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAL131910B</td><td></td></tr><tr><td>painel de vidro</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>7 in x 5 in painel de vidro retirado da moldura&nbsp;</td></tr><tr><td>pipeta de vidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td>usada para criar placa quente de palheta de platina</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>SP88857104</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de Magnésio</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA3333736</td><td></td></tr><tr><td>lâminas de microscópio&nbsp;</td><td>Ágar de grau de biologia molecular Mckesson</td><td>938360</td><td></td></tr><tr><td></td>Fosfato de Potássio <td>Dibásico A1705</td><td></td> <td>da Benchmark Scientific</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P290-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de Potássio monobásico&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>Azida de Sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ2161022</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Sódio&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>tampa de vidro quadrada</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541-016</td><td></td></tr><tr><td>SYLCAP 284-F (Cura Rápida) Kit de Encapsulante de Elastômero de Silicone, Transparente, Opticamente Transparente, Mistura 10:1, 500 Gm/ML (0.5 Kg), Mais Rápido que Sylgard 184 e Similares&nbsp;</td><td>Dessecador a vácuo MicroLubrol</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td>Prato de pesagem <td>Fisher Scientific</td><td>08-648-100</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Fisher Científico</td><td>01-549-750</td><td></td></tr></tbody></table>

ajuste fino da orientação de caenorhabditis elegans em almofadas de ágar canalizadas para neuroregeneração de imagem

Fine Adjustment of Caenorhabditis elegans Orientation on Channeled Agar Pads for Imaging Neuroregeneration

Fabricação de moldes PDMS O ciclo da pressão de vácuo durante a fabricação do molde perfura e remove as bolhas de ar do PDMS não curado, garantindo um molde sem bolhas. Como mostrado na Figura 3D , as bolhas sobem à superfície e perfuram. Moldes sem bolhas podem produzir canais limpos.
Solidificação do molde PDMS Ao colocar o painel de vidro no disco de vinil, evite criar espaços de ar. Essas lacunas podem levar a espessuras irregulares ou defeitos superficiais. Bolhas, se presentes, podem ser detectadas visualmente. Pressionar o painel de vidro de um lado para o outro desloca o ar, minimizando a formação de bolhas e garantindo uma espessura uniforme do molde mostrada na Figura 4A.
Usando almofadas de ágar canalizadas para orientação fina de C. elegans As almofadas de ágar canalizadas permitem a orientação precisa de C. elegans. Definimos a orientação do animal rolando levemente o animal com uma palheta de fio de platina, enquanto verificamos a orientação usando pontos de referência, como a vulva ou o intestino em forma de S (Figura 5A, C). Confirmamos a orientação sob um microscópio de dissecação fluorescente antes de transferir os animais para um microscópio invertido mostrado na Figura 5B,D.
Avaliação da regeneração de fibras neuronais com almofadas de ágar canalizadas As almofadas de ágar canalizadas melhoram a qualidade da imagem da regeneração neuronal, orientando o animal de maneira ideal. O posicionamento das fibras dos neurônios regenerados mais perto da lente objetiva reduz a dispersão e a absorção de luz, aumentando a clareza da imagem. A Figura 5E, F mostra que colocar o local de regeneração mais próximo da objetiva melhora a qualidade da imagem, facilitando uma análise mais precisa do crescimento neuronal.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67811/67811fig01.jpg"> 
Figura 1: Caenorhabditis elegans em almofadas planas e canalizadas. (A) Animal em almofada de ágar plana na orientação DV; vulva enfrenta lamínula. (B) A introdução de lamínula empurra a vulva para o lado, forçando o animal a se orientar lateralmente. (C) Animal em almofada de ágar canalizada na orientação DV. (D) O animal permanece na orientação DV após a introdução da lamínula. (E) Imagem de campo claro do rolo mutante em almofada de ágar canalizada na orientação DV. (F) Imagem de campo claro com lamínula, o mesmo animal que E permanece na orientação DV. Abreviaturas: DV = dorsal-ventral; lat = lateral. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67811/67811fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67811/67811fig02.jpg"> 
Figura 2: Materiais e equipamentos para fabricação de PDMS. (A) Kit de elastômero de silicone SYLCAP 284-F. (B) Escala. (C) Seringa de plástico. (D) Dessecador a vácuo. (E) Placa quente. (F) Disco de vinil de 12 polegadas de longa duração, desmonta conforme necessário. (G) Painel de vidro. Abreviatura: PDMS = polidimetilsiloxano. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67811/67811fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67811/67811fig03.jpg"> 
Figura 3: Mistura e aspiração de PDMS não curado. (A) Misture a base e o agente de cura na bandeja. (B) Coloque a bandeja em uma câmara de vácuo. (C) Cicle o vácuo três vezes para permitir que as bolhas apareçam. (D) Depois de uma hora, a maioria das bolhas estourou. Observe a transmissão aprimorada por meio do PDMS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67811/67811fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67811/67811fig04.jpg"> 
Figura 4: Introdução de um painel de vidro ao PDMS não curado sem bolhas. (A) Introdução de painel de vidro em disco de vinil sem bolhas. (B) Molde PDMS solidificado removido do registro, com canais de detalhamento inseridos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67811/67811fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67811/67811fig05.jpg"> 
Figura 5: Imagens de campo claro e fluorescência de C. elegans montadas em ágar canalizado. (A) Imagem de campo claro de um animal em orientação DV bilateral. Marco anatômico para orientação DV: intestino espiral em forma de S (tecido mais escuro indicado por seta) cruzando a linha média ~ 60% da distância do nariz à cauda. (B) Imagem de fluorescência de neurônios na orientação DV, mesmo animal que A. (C) Imagem de campo claro de um animal na orientação lat. Ponto de referência anatômico para orientação lateral: vulva voltada para o lado. (D) Imagem de fluorescência de neurônios na orientação lat, mesmo animal que C. (E) Orientação com regeneração (seta) no lado mais profundo (distante) de um animal. (F) Orientação com regeneração em animal lateral mais raso mais próximo do objetivo; regeneração mais clara (seta). Barras de escala = 20 μm. Abreviaturas: DV = dorsal-ventral; lat = lateral. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67811/67811fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Ajuste fino da orientação de Caenorhabditis elegans em almofadas de ágar canalizadas para neuroregeneração de imagem

Caenorhabditis elegans is a model organism widely used for studying biological processes. Its transparency and small size make it ideal for imaging ...

fine-adjustment-caenorhabditis-elegans-orientation-on-channeled-agar

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Durante a imagem ao vivo de C. elegans, uma almofada de agarose pode ser usada para manter o nematóide imóvel sem danificá-lo ou secá-lo. Este vídeo descreve como preparar uma almofada de montagem simples para microscopia.

Preparação de lâminas de nematóides: um método para montar animais em uma almofada de ágar

Fonte: Doser, R., et al. Imagem subcelular do manuseio de cálcio neuronal in vivo. J. Vis. Exp. (2023)Este vídeo demonstra imagens in vivo do fluxo de cálcio subcelular nos neurônios do cordão nervoso ventral de cepas transgênicas de Caenorhabditis elegans. Dois indicadores distintos de cálcio são empregados: um indicador citoplasmático em uma cepa e um indicador mitocondrial em outra. Os neurônios são observados sob um microscópio de fluorescência para monitorar mudanças em tempo real na...

Imagem da dinâmica do cálcio subcelular em neurônios de Caenorhabditis elegans

Com o seu pequeno corpo transparente, neuroanatomia bem documentado e uma série de técnicas genéticas passíveis e...

Na imagem cálcio vivo Neuronal em C. elegans

Nós descrevemos métodos para estudar aspectos da amylopathies do...

A<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Sistema Modelo para Estudo Amylopathy

Este protocolo descreve como as células em divisão imagem dentro de um tecido em Caenorhabditis elegans embriões. Embora vários protocolos descrevem como a divisão celular imagem no embrião precoce, este protocolo descreve como imagem divisão celular dentro de um tecido em desenvolvimento em meados embriogénese tardia.

Visualizando neuroblasto Cytokinesis Durante<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriogênese

Comportamento de imagem e atividade neural em longas escalas de tempo sem imobilização do animal é um pré-requisito para entender o comportamento. A imagem das câmaras microfluídicas de agarose (IAM) pode ser usada para obter imagens da atividade neural e do comportamento de todos os estágios da vida de Caenorhabditis elegans.

Microchambers agarose para Imagem de cálcio a longo prazo de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans (C. elegans) é um bom modelo para estudar o transporte axonal e intracelular. Aqui, eu descrevo um protocolo para análise de transporte axonal e em c. eleganse in vivo de gravação.

Imobilização de Caenorhabditis elegans , para analisar o transporte intracelular nos neurônios

Este estudo esboça medidas quantitativas do tamanho e da localização sináptica, da morfologia do músculo, e da forma mitochondrial em C. elegans usando ferramentas livremente disponíveis do processamento de imagem. Esta aproximação permite que os estudos futuros em C. elegans comparem quantitativamente a extensão de mudanças estruturais do tecido e do organela em conseqüência das mutações genéticas.

Abordagens quantitativas para o estudo de estruturas celulares e morfologia organelle em Caenorhabditis elegans

Foi apresentado um protocolo para a imagem dos microtúbulos dinâmicos in vivo usando proteína de ligação final rotulada fluorescente. Descrevemos os métodos para rotular, imagem e analisar os microtúbulos dinâmicos no neurônio de microtúbulo lateral posterior (PLM) de C. elegans.

In vivo Avaliação da Dinâmica e Orientação em Caenorhabditis elegans Neurônios

O artigo descreve a otimização dos parâmetros de aquisição da microscopia de fluorescência para visualizar o transporte axonal de cargas marcadas endógenas com resolução de neurônio único em um nematóide vivo.

Otimizando a visualização do transporte axonal de carga endógena por microscopia de fluorescência em Caenorhabditis elegans vivos

Aprenda a criar almofadas de ágar canalizadas usando moldes de PDMS para orientar Caenorhabditis elegans em estudos de neuroregeneração. Este método melhora a qualidade da imagem e facilita a análise de estruturas neuronais.

Ajuste fino da orientação de Caenorhabditis elegans em almofadas de ágar canalizadas para neuroregeneração de imagem

Explorar mais vídeos