Protocolo de injeção direta do nervo vago para ratos

Realizamos estudos pré-clínicos em terapia de substituição de genes. Usamos animais de laboratório para estabelecer o método ideal de administração de medicamentos para resolver problemas de sistemas nervosos autônomos e periféricos. A terapia de substituição de genes baseada em vetores é uma das tecnologias emergentes em terapia gênica. A aplicação do vetor viral associado ao adino é uma das opções potenciais disponíveis agora. O AAV9 tem sido amplamente utilizado na pesquisa de terapia gênica para entregar o gene de interesse ao sistema nervoso central e periférico. Os pesquisadores não têm opções suficientes disponíveis para administrar agentes medicamentosos diretamente no sistema nervoso periférico. Existem situações que envolvem distúrbios neurológicos causados pelo sistema nervoso periférico ou autônomo. No entanto, falta um método eficaz de administração de medicamentos para lidar com essas situações.

Este método demonstra uma maneira de administrar os agentes medicamentosos diretamente nos nervos vagos para resolver o problema do sistema nervoso autônomo em estudos pré-clínicos usando ratos. Além disso, esse método pode ser exportado para administrar medicamentos por meio de outros nervos periféricos com modificações necessárias em outras espécies. O laboratório cinza continuará a pesquisa de terapia genética pré-clínica mediada por AV usando roedores e animais de grande porte. Além disso, estávamos focados no desenvolvimento de novos métodos aplicáveis para pavimentar a estratégia de terapia de substituição gênica.

[Narrador] Para começar, conecte uma seringa de vidro de 100 microlitros com o êmbolo removido a uma agulha de calibre 27. Conecte uma extremidade de aproximadamente 45 centímetros de tubo de polietileno esterilizado à agulha de calibre 27, em seguida, encaixe uma seringa de plástico de três mililitros com uma agulha de calibre 27 e carregue a seringa com aproximadamente 0,5 mililitros de solução salina normal a 0,9%. Use a solução salina normal a 0,9% para encher o tubo de polietileno a partir da extremidade aberta, garantindo que todo o comprimento do tubo e o cilindro da seringa de vidro sejam preenchidos até que a solução salina transborde. Uma vez feito isso, remova e descarte a seringa de três mililitros e sua agulha. Agora insira o êmbolo no cilindro da seringa de vidro e empurre-o ligeiramente para a frente até o meio do cilindro e coloque a seringa de vidro na bomba da seringa. Use a bomba de seringa para puxar o êmbolo ligeiramente para trás, criando um espaço aéreo de aproximadamente 1,5 centímetros na extremidade aberta da tubulação. Pipete pelo menos cinco microlitros de corante e mistura de medicamentos candidatos usando uma micropipeta de 10 microlitros em um pedaço esterilizado de filme para. Retire a mistura de medicamentos candidatos para o tubo com a ajuda da bomba de seringa e marque o nível da mistura de injeção com um marcador. Encaixe uma agulha de calibre 35 no tubo e prenda-a a uma superfície limpa no estágio cirúrgico com fita adesiva, garantindo que permaneça fixa, esterilizada e não toque em mais nada. Ligue a bomba de seringa por 10 a 15 segundos até que a solução injetável comece a emergir da ponta da agulha. Transfira o rato anestesiado para uma mesa equipada para depilação e preparação do local. Aplique pomada lacrimal artificial em ambos os olhos do rato para evitar o ressecamento excessivo. Administre analgésicos de acordo com o protocolo institucional aprovado para controlar a dor quando o rato recuperar a consciência. Raspou o lado ventral do pescoço na região cervical e estendeu-o até aproximadamente dois centímetros perpendicularmente da linha média em ambos os lados, do queixo ao esterno. Esterilizou a área raspada três vezes com álcool etílico 70% e betadine 10%, limpando para fora em um padrão circular. Transferir o rato para a fase cirúrgica em decúbito dorsal ao microscópio de dissecação. Certifique-se de que a almofada de aquecimento sob o rato esteja temperada adequadamente e ajuste os microscópios focados para visualizar a região cervical para cirurgia. Prenda os ratos ou os dentes da mandíbula com uma sutura não absorvível. Fixe a extremidade aberta da sutura dentro do cone do nariz para manter as narinas dentro do cone do nariz durante a anestesia. Posicione o rato de forma que sua cabeça fique do lado esquerdo do cirurgião destro. Coloque uma almofada de gaze esterilizada sob o pescoço para alinhar e endireite a região cervical. Cubra o corpo do rato com uma cortina esterilizada deixando a área cirúrgica exposta. Fixe quatro pinos retratores com fixadores magnéticos nos quatro cantos do estágio cirúrgico. Agora, injete anestésicos locais epidérmicos na linha média da região cervical onde será feita a incisão. Use uma lâmina de bisturi para fazer uma incisão longitudinal de dois centímetros na linha média entre o queixo e o esterno na região cervical ventral. Em seguida, com pontas de algodão esterilizadas, o blunt separa as bordas da pele cortada. Usando as pontas do retrator, retraia as bordas separadas da pele em direções opostas. Separe a fáscia usando pontas de algodão para ir mais fundo e empurre as glândulas salivares lateralmente. Agora, separe os músculos mastóideos do esterno com pontas de algodão e retraia-os lateralmente com pinos retratores. Continue separando o tecido no lado esquerdo da traqueia até que a bainha carotídea fique visível. Use uma pinça fina para criar um pequeno orifício na bainha carotídea sem danificar a artéria carótida e separe cuidadosamente o nervo vago esquerdo da artéria carótida comum. Uma vez que o nervo é separado da artéria usando uma pinça, use uma agulha curva de calibre 25 encaixada em uma seringa de um mililitro para enganchar e segure o nervo com a mão não dominante. Segure a agulha carregada com a mistura de corante de drogas candidata com a mão dominante. Para facilitar uma picada suave, mantenha o nervo reto puxando-o suavemente usando o gancho de calibre 25. insira a agulha no nervo e avance-a mais de 0,5 centímetros, mantendo a agulha paralela ao nervo vago. Puxe ligeiramente para trás para que aproximadamente 0,4 a 0,5 centímetros da agulha permaneçam dentro do nervo. Limite o número de picadas nervosas com uma única agulha a não mais do que três vezes. Depois de confirmar a inserção da agulha, mantenha sua posição sem movimento e ligue a bomba da seringa. Monitore a infusão para garantir que ela permaneça dentro do nervo e flua suavemente. Use o ponto marcado no tubo de infusão para rastrear o movimento da mistura de corante de drogas. Observe como o nervo começa a desenvolver a cor do corante. Remova a agulha curva de calibre 25 e, usando pontas de algodão estéreis, mova suavemente os lenços de volta à sua posição original. Em seguida, remova as pontas do retrator. Feche a ferida com uma sutura absorvível ou não absorvível e aplique uma pequena quantidade de cola de tecido entre os pontos, se necessário, para garantir que a ferida feche perfeitamente.