Método novo e eficiente para coloração de fluorescência cardíaca de Drosophila com crioseccionamento

Meu laboratório de pesquisa usa o modelo de drosófila para estudar o envelhecimento e o distúrbio metabólico, explorando a alimentação e o exercício com restrição de tempo como intervenção para doenças metabólicas, musculares cardíacas, do sono e outras doenças do envelhecimento. O aprendizado de máquina e a ômica com estratégia fisiológica, genética e nutricional estão simplificando o ensaio de drosófila usando dispositivos impressos em 3D e abordagens de aprendizado de máquina. A imuno-histoquímica fluorescente de corações de drosófilas permite a detecção de múltiplas proteínas em genótipos e idades, mas enfrenta desafios como dissecções complexas, preservação de tecidos e imagens de alta resolução de padrões específicos de expressão de proteínas.

Este protocolo melhora a preservação do tecido, a penetração de anticorpos e a resolução da imagem, permitindo melhores visualizações dos marcadores de proteínas cardíacas. Ele aborda desafios como dissecção complexa, danos teciduais e resolução limitada no método tradicional de montagem de todo o coração. Este protocolo aumenta a acessibilidade da pesquisa cardíaca de drosófila, eliminando dissecção complexa, permitindo a execução com uma mão e evitando microscopia confocal cara, tornando a imagem de alta resolução mais viável.

Para começar, anestesiar 5 a 10 moscas usando um tapete de dióxido de carbono. Posicione as moscas à vista sob o microscópio com ampliação de 1X a 2X. Usando uma tesoura de mola, decapite as moscas, corte as asas e remova as pernas.

Retenha o tórax e o abdômen juntos, chamados de corpo. Usando um pincel, coloque suavemente os corpos em tubos rotulados de 1,5 mililitro no gelo até que todos os grupos experimentais tenham sido coletados. Depois de remover os tubos do gelo, adicione 100 microlitros de ácido etilenoglicol tetracético 10 milimolar a pH 8 a cada tubo.

Certifique-se de que todos os corpos estejam submersos e coloque os tubos em um agitador orbital por 10 minutos. Em seguida, remova e descarte a solução de ácido etilenoglicol tetracético dos tubos. Pipete 100 microlitros de PBS em cada tubo para lavar o tecido por 10 minutos.

Coloque os tubos no agitador orbital durante o processo de lavagem. Depois de descartar o PBS, pipetar 100 microlitros de paraformaldeído a 4% em solução de PBS em cada tubo. Coloque os tubos em um agitador orbital a 100 unidades por 15 minutos, garantindo que os tecidos permaneçam em contato com a solução.

Em seguida, descarte a solução de paraformaldeído. Quando a lavagem final estiver concluída, transfira os corpos para uma solução de sacarose a 10% em PBS. Certifique-se de que os corpos estejam em contato com a solução dentro do tubo.

Recupere o gelo seco do armazenamento e selecione algumas peças para colocar em uma pequena bandeja de metal ou plástico. Escolha uma bandeja com dimensões que permitam inserir o molde e coloque-a diretamente em cima de um único pedaço grande e plano de gelo seco. Encha um molde rotulado a 50% com temperatura de corte ideal, ou composto OCT, despejando lentamente para minimizar as bolhas.

Com um pincel, coloque cuidadosamente os corpos de drosófila dissecados e fixados na superfície do composto OCT dentro do molde. Usando uma pinça, empurre cada corpo para o fundo do molde com a parede dorsal do tórax e do abdômen geralmente alinhada ao longo da parte inferior. Ajuste os corpos de forma que o abdômen fique plano ao longo da parte inferior do molde.

Alinhe todos os corpos nas dimensões X, Y e Z para garantir que cada seção inclua todos os assuntos simultaneamente. Corrija a curvatura do abdômen, especialmente nos homens, para achatá-lo o máximo possível sem perfurar ou esmagar os corpos. Quando todos os assuntos estiverem no lugar, posicione o molde de forma que o fundo fique diretamente em cima de um pedaço de gelo seco.

Certifique-se de que o composto OCT comece a congelar ao entrar em contato e continue até que todos os assuntos estejam totalmente envoltos no molde. Após o congelamento, transfira o molde para um freezer ajustado para menos 20 graus Celsius para permitir o congelamento completo. Depois de totalmente congelado, preencha a parte restante do molde com composto OCT.

Para prender uma broca de mandril ao molde, aplique uma quantidade generosa de composto OCT no bloco. Pressione a broca no composto e deixe-a congelar completamente no criostato, normalmente em cinco minutos. Em seguida, solte a broca do mandril e o bloco OCT do molde.

Coloque a broca no mandril, certificando-se de que o bloco permaneça devidamente orientado de cima para baixo e aperte a chave do mandril para prender a broca. Agora, usando os botões de ajuste e os controles de profundidade do mandril, alinhe o bloco com a lâmina e defina a largura da seção para 20 micrômetros ou menos. Corte cada fatia do bloco usando um movimento lento, mas consistente, permitindo que o vidro anti-rolo capture cada fatia à medida que é cortada.

Colete as seções usando lâminas aquecidas. Com uma lâmina de barbear, remova o excesso de composto OCT ao redor das seções. Contorne a borda de cada lâmina usando um marcador hidrofóbico para manter as soluções de lavagem e coloração confinadas ao tecido.

Usando uma pipeta de 1000 microlitros, lave as lâminas três vezes com PBS por cinco minutos cada sem tocar no tecido. Depois de descartar a lavagem final, pipetar a solução de corante fluorescente nos tecidos e incubar por uma hora em temperatura ambiente no escuro. Em seguida, descarte a mancha fluorescente e lave as lâminas três vezes por cinco minutos cada com PBS.

Depois, descarte a lavagem final do PBS, deixando uma pequena quantidade de solução na lâmina. Usando uma pipeta de 1000 microlitros, pipete de três a cinco gotas de mídia de montagem na lâmina, evitando a aplicação direta no tecido. Usando uma pinça, posicione a lamínula em uma borda e abaixe gradualmente o outro lado até que esteja nivelado com a corrediça.

Sele as corrediças com esmalte sem neon ou glitter. Se o meio de montagem não estiver endurecendo, dependendo da mancha fluorescente, crie uma imagem imediatamente ou guarde os slides para mais tarde. Antes de fazer a imagem, inspecione as lâminas quanto à limpeza e limpe-as suavemente usando um lenço de papel com uma solução de etanol a 70% em água.

Analise os sujeitos fluorescentes mais brilhantes dentro do experimento para selecionar os tempos de exposição apropriados para cada canal de fluorescência. Pesquise cada grupo experimental em uma visualização ao vivo de todos os canais para confirmar as configurações de exposição corretas. Para consistência, foque em cada assunto usando o mesmo canal de fluorescência e capture imagens para todos os assuntos.

Após a geração de imagens, armazene as lâminas no escuro a quatro graus Celsius para futura recaptura de imagem. O método de imagem de fluorescência preservou as principais características do coração da drosófila, como óstios, válvula, fibras longitudinais e fibras circunferenciais. Toda a estrutura do tubo cardíaco e as estruturas menores detalhadas foram capturadas em diferentes ampliações, com aumentos de 10X para toda a estrutura e ampliações de 40X a 60X mostrando detalhes mais finos, como fibras contráteis circunferenciais e fibras estabilizadoras longitudinais.

Micrografias de fluorescência representativas demonstraram estruturas cardíacas preservadas em drosófilas w1118 com núcleos corados com DAPI, lipídios corados de verde e miofibrilas contendo actina coradas de vermelho com faloidina. A coloração com faloidina destacou efetivamente as fibras longitudinais e circunferenciais, demonstrando a estrutura do filamento de actina preservada apesar das tensões de congelamento e seccionamento. A coloração de manchas lipídicas revelou armazenamento de gordura localizado próximo ao tubo cardíaco.