Desenvolvimento e Avaliação de Modelos de Infecção Intracelular para Staphylococcus aureus

Nossa pesquisa se concentra em infecções por Staphylococcus aureus com o objetivo de estabelecer um modelo de infecção intercelular. Este modelo fornecerá informações valiosas sobre o mecanismo subjacente às infecções intercelulares e contribuirá para o desenvolvimento de idade estrita para sua prevenção e tratamento. O progresso mais recente na infecção intracelular por Staphylococcus aureus é estudar o mecanismo de infecção para regular a sobrevivência e a disseminação de bactérias dentro da célula, e adicionará para otimizar a droga e a modificação estrutural para melhorar mais efeito terapêutico.

Este campo de pesquisa usa cultura de células, tecnologia de sequenciamento emergente de células, oxitérmicos de alto combustível, tecnologia de edição de genes e outras tecnologias relacionadas para estudar a infecção bacteriana nas células. Em contraste com os modelos tradicionais de infecção, refinamos as condições experimentais específicas para infecções intracelulares. Depois de infectar as células com staphylococcus aureus individualmente, as células infectadas pela bactéria são inoculadas em camundongos para estabelecer infecções intracelulares.

Essa abordagem melhora a eficiência, minimizando a interferência das bactérias livres, garantindo uma retenção mais precisa do processo de infecção intracelular. Nosso método se concentrará no desenvolvimento de medicamentos com anticorpos e avançará para prevenir e tratar infecções bacterianas no futuro. Para preparar um caldo de amido a 6%, adicione extrato de carne em pó, triptona e cloreto de sódio a um recipiente de vidro sucessivamente na proporção de massa de 3 a 10 a 5.

Adicione 100 mililitros de água bidestilada e mexa para dissolver os componentes. Aqueça a solução no microondas. Em seguida, adicione amido solúvel em uma proporção de massa de 6 e mexa a mistura até dissolver completamente.

Autoclave o caldo a 121 graus Celsius por 30 minutos. Depois de esterilizado, armazene o caldo a quatro graus Celsius até formar uma pasta. Para coletar macrófagos peritoneais de camundongos, usando a mão esquerda, agarre o pescoço do camundongo e controle sua cauda.

Em seguida, vire o mouse para que sua cabeça fique posicionada para baixo e seu abdômen voltado para cima. Administre uma injeção intraperitoneal de três mililitros de caldo de amido a 6% no camundongo. Após 72 horas da injeção, sacrifique o camundongo anestesiado e desinfete-o com álcool etílico a 75%.

Usando uma tesoura oftálmica, corte o abdômen do camundongo para expor totalmente o peritônio. Injete 10 mililitros de DMEM na cavidade abdominal por meio de injeção intraperitoneal. Esfregue suavemente o abdômen por um minuto para lavar a cavidade.

Em seguida, use uma seringa para coletar o fluido lavado em um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Centrifugue o líquido de lavagem a 300 G durante cinco minutos e elimine o sobrenadante. Ressuspenda o pellet celular em 10 mililitros de DMEM suplementado com 10% de FBS, penicilina e estreptomicina.

Pegue 10 microlitros de suspensão celular e adicione-o ao contador de células para contar as células. Dilua as células a uma concentração de 2 vezes 10 elevado a 6 células por mililitro com DMEM FBS. Coloque um mililitro de suspensão celular por poço em uma placa de seis poços.

Incube a placa a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por quatro horas. Após a incubação, remova o sobrenadante. Lave as células duas vezes com PBS estéril e cultive-as durante a noite com um mililitro de DMEM por poço nas mesmas condições.

Incubar os macrófagos peritoneais com staphylococcus aureus MRSA-252 por duas horas. Remova o sobrenadante e lave as células duas vezes com PBS. Adicione um mililitro por alvéolo de meio DMEM completo contendo 100 microgramas por mililitro de gentamicina e incube por duas horas a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono.

Após a incubação, lave as células três vezes com PBS. Usando um raspador de células, colete os macrófagos peritoneais em tubos de centrífuga de 50 mililitros. Centrifugar as amostras a 1000 g durante cinco minutos.

Adicione 10 microgramas por mililitro de lisozima aos macrófagos infectados com MRSA-252 intracelular e incube a 37 graus Celsius por 10 minutos. Depois de lavar as células duas vezes com PBS, suspenda-as novamente em um mililitro de PBS. Em seguida, retire cerca de 20 microlitros de alíquota e adicione 0,1% Triton X-100 por cinco minutos para lisar as células.

Efectuar diluições em série da suspensão de células lisadas com PBS e colocá-las numa placa de trado de soja tríptica. Incube a placa durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte, conte as colônias bacterianas para calcular as bactérias MRSA-252 intracelulares em macrófagos peritoneais.

Coloque o mouse sob uma lâmpada de fisioterapia infravermelha até que a veia da cauda esteja dilatada. Divida aleatoriamente os ratos em quatro grupos. Injete por via intravenosa 3 vezes 10 elevado a 6 UFC MRSA-252 planctônico na veia da cauda do camundongo.

Após 24 horas, sacrifique o camundongo anestesiado e desinfete-o completamente com álcool etílico a 75%. Use uma pinça com uma mão para levantar a pele abdominal e com a outra mão corte a pele usando uma tesoura oftálmica. Localize os rins na cavidade abdominal e retire-os cuidadosamente completamente.

Transfira os rins para um tubo de moagem contendo um mililitro de PBS e triture-os até que não reste tecido sólido. Despeje o tecido homogeneizado no tubo Eppendorf. Realize diluições seriadas do homogeneizado tecidual usando PBS.

Localize cada diluição em placas de trado de soja tríptico separadas e incube-as durante a noite a 37 graus Celsius. Conte as colônias bacterianas no dia seguinte e analise os dados. Modelos de infecção intracelular de S. aureus foram estabelecidos com sucesso sob condições otimizadas de fagocitose e tratamento antibiótico estendido com algumas bactérias sobrevivendo dentro de macrófagos.

Macrófagos infectados com S.aureus resistente à meticilina retiveram bactérias intracelulares após duas horas de tratamento com antibióticos, quando o sobrenadante não continha mais bactérias. In vivo, ensaios de colonização bacteriana em camundongos mostraram que a vancomicina eliminou S. aureus extracelular, mas não conseguiu eliminar bactérias intracelulares.