Análise da Expressão de Oncogenes com Alterações no pH em uma Linhagem Celular Ductal Pancreática

Nos hospitais da AIG, investigamos como a diminuição das secreções ductais pancreáticas e a diminuição do pH afetam as expressões gênicas nas células ductais pancreáticas, especialmente com foco nos oncogenes, explorando a possibilidade de adaptação celular a microambientes ácidos. O desafio aqui é a heterogeneidade dos tumores pancreáticos, o que dificulta o tratamento e as abordagens experimentais. Assim, realizamos a análise de RNAC de células ductais pancreáticas sob condições de pH reduzido e descobrimos que há aumento da expressão de três oncogenes, destacando as ligações potenciais entre o ambiente ácido e a expressão de oncogenes em células ductais pancreáticas.

Nosso estudo lançou luz sobre a expressão do oncogene sob condições de pH reduzido, e esse sistema pode avançar nossa pesquisa no estudo do adenocarcinoma ductal pancreático sob condições de inflamação. Portanto, o escopo futuro deste estudo é avaliar o papel do aumento da expressão de oncogenes no início de tumores em condições inflamatórias, como na pancreatite crônica. Para começar, adquira a linha de células ductais pancreáticas normais humanas.

Descongele as células a 37 graus Celsius em banho-maria. Agora filtre o meio completo recém-preparado através de um filtro de seringa. Adicione seis mililitros de meio completo a um novo tubo cônico de 15 mililitros.

Em seguida, transfira a suspensão celular descongelada para o tubo e misture bem. Centrifugar a suspensão a 1 800 g durante seis minutos. Rejeitar o sobrenadante e adicionar um mililitro de meio de cultura ao pellet antes de misturar suavemente.

Em seguida, adicione quatro mililitros de meio completo em uma placa de Petri de 60 milímetros. Em seguida, pipetar a suspensão celular gota a gota para o balão. Incubar a cultura a 37 graus Celsius sob 5% de suplementação de dióxido de carbono.

Para alterar o pH do meio de cultura, primeiro prepare 100 mililitros de soluções tampão de fosfato de sódio 0,5 molar com valores de pH de 6,0, 6,5 e 7,0. Verifique o pH com um medidor de pH e ajuste-o usando um ácido clorídrico molar ou um hidróxido de sódio molar. Em seguida, filtre, esterilize os tampões em uma capela de fluxo de ar laminar usando um filtro de seringa de 0,45 micrômetro.

Em seguida, adicione 20 mililitros de tampão fosfato de sódio 0,5 molar estéril do respectivo pH a 80 mililitros de meio de cultura para preparar meios de pH diferente. Adicione o meio com o pH alterado a 85 a 90% de células ductais pancreáticas humanas confluentes. Observe as mudanças morfológicas sob um microscópio de campo claro em intervalos de uma hora por seis horas.

Para isolar o RNA da cultura, aspire primeiro o meio de cultura e enxágue as células com um mililitro de PBS. Coloque o prato de 60 milímetros no gelo, depois um mililitro de PBS no prato de 60 milímetros e raspe as células com um raspador de células. Agora transfira a suspensão para um novo tubo.

Centrifugar a 8 000 g durante 10 minutos e rejeitar o sobrenadante. Em seguida, adicione 600 microlitros de tampão de lise contendo beta-mercaptoetanol ao pellet. Pipete a suspensão para cima e para baixo por cinco a 10 minutos no gelo.

Adicione um volume igual de etanol a 70% ao lisado e pipete a suspensão para misturar bem. Transferir a solução para uma coluna de membrana de sílica. Em seguida, centrifugar a coluna a mais de 8 000 g durante 30 segundos e rejeitar o fluxo.

Em seguida, adicione 500 microlitros de tampão de lavagem à amostra e centrifugue novamente. Centrifugue o tubo vazio por um minuto a mais de 8.000 G. Finalmente, adicione 30 a 50 microlitros de água livre de nuclease à coluna. Após uma incubação de cinco minutos à temperatura ambiente, centrifugar novamente a coluna a velocidades superiores a 8 000 g durante cinco minutos.

Foi observada uma redução significativa no tamanho das células e encolhimento das células dúcteis em meio ácido em comparação com as células mantidas em meio normal. As mudanças mais pronunciadas na morte celular ocorreram após seis horas de incubação, com uma diminuição adicional na contagem de células e sinais de estresse celular em 22 horas. O número de genes regulados positivamente foi maior em pH 6,5 com 148 genes, seguido por pH sete com 109 genes e pH seis com 90 genes.

Os genes regulados negativamente foram menos com 20 em pH seis, 14 em pH 6,5 e 23 em pH sete. Três oncogenes, LCK, FGR e ASAP três foram regulados positivamente em todos os níveis de pH testados, sugerindo um papel na proliferação celular em condições ácidas.