Isolamento e cultura de adipócitos murinos primários de camundongos magros e obesos
24 de janeiro de 2025
O tamanho e a fragilidade dos adipócitos maduros limitaram as técnicas e ferramentas disponíveis para seu estudo e isolamento. Aqui, é descrito um protocolo para o isolamento de adipócitos murinos maduros, que pode ser facilmente adaptado para diferentes depósitos adiposos e dietas de camundongos.
Nossa pesquisa se concentra em investigar a função de adipócitos maduros de diferentes depósitos de gordura e condições dietéticas. Estamos especificamente interessados em entender como os adipócitos maduros se comunicam com as células circundantes e como essa conversa cruzada pode influenciar a progressão da doença e ser alterada na obesidade. Os adipócitos maduros são células grandes e delicadas, o que torna os métodos de isolamento celular comumente usados, como o FACS, ineficazes.
Além disso, altos níveis de lipídios livres frequentemente encontrados no tecido adiposo podem ser tóxicos para os adipócitos maduros, complicando sua manutenção. Em contraste com os métodos comumente usados que dependem da diferenciação in vitro de pré-adipócitos, este protocolo nos permite estudar adipócitos isolados ex vivo, que são funcional e transcricionalmente semelhantes aos adipócitos in vivo. Isso é particularmente importante, pois os adipócitos variam muito entre os depósitos de gordura e em diferentes condições de dieta.
Este protocolo isola eficientemente, espelhando adipócitos maduros e é facilmente escalável. Ajustes são incluídos para otimizar o isolamento de adipócitos de camundongos de diferentes sexos e com diferentes condições alimentares. Uma vez isolados, os adipócitos podem ser cultivados, fotografados ou usados conforme necessário.
Para começar, prepare uma solução de colagenase com DNase adicionando 0,00017 gramas de DNase por um mililitro de solução de colagenase e vortex a mistura para garantir a mistura completa. Usando uma lâmina de barbear, pique o tecido adiposo dos camundongos isolados até que pareça homogêneo. Em seguida, transfira o tecido picado para um tubo cônico estéril de 50 mililitros.
Adicione a solução preparada de colagenase e DNase ao tecido adiposo picado e ao vórtice na velocidade máxima por sete a 10 segundos para misturar bem os componentes. Em seguida, coloque os tubos cônicos de 50 mililitros horizontalmente em um agitador ajustado para 220 RPM a 37 graus Celsius por 10 minutos. Após a incubação, remova os tubos, vortex por cinco segundos e verifique as amostras.
Agora, usando uma pipeta sorológica, passe o tecido digerido por uma peneira para um novo tubo cônico estéril de 50 mililitros. Adicione FBS igual ao volume de tecido e solução de colagenase através da peneira no mesmo tubo cônico para neutralizar a colagenase. Gire os tubos a 300 G por três minutos na temperatura especificada na tabela mostrada aqui.
Em seguida, usando uma pipeta de 200 microlitros, descarte cuidadosamente a camada superior de lipídios livres. Em seguida, use uma pipeta P1000 com a ponta cortada para transferir os adipócitos maduros para um tubo preparado de 15 mililitros contendo 10 mililitros de meio de crescimento. Inverta suavemente os tubos de 15 mililitros contendo adipócitos maduros três a cinco vezes até que a camada branca se disperse por todo o meio.
Depois de descansar os tubos por 10 minutos, gire-os na temperatura previamente determinada para separar ainda mais as camadas. Depois disso, use uma pipeta para descartar a camada superior de lipídios livres. Agora conecte uma agulha de calibre 21 a uma seringa de cinco mililitros e deslize cuidadosamente a agulha pela borda do tubo até que a parte inferior da agulha esteja abaixo da camada do local dos adipócitos maduros.
Em seguida, puxe lentamente a seringa para remover o meio de cultura e quaisquer detritos celulares. Adicione suavemente 10 mililitros de meios de cultura ao tubo. Usando pontas de pipeta de carregamento de gel Deslize a ponta para baixo na borda do tubo para remover o meio restante abaixo da camada de adipócitos maduros.
Em seguida, centrifugue as células a 100 G durante um minuto. Usando uma pipeta, remova os lipídios livres. Usando uma ponta de pipeta de carregamento de gel, remova o meio de cultura abaixo dos adipócitos.
Remova as inserções de cultura de células de uma placa de 24 poços tratada com cultura de tecidos e coloque-as com a membrana voltada para cima na superfície do capuz. Encha os poços alternados da placa com meios de cultura quentes. Usando uma ponta de pipeta P200 cortada, transfira 30 microlitros de adipócitos maduros embalados para o topo de uma inserção Transwell.
Em seguida, pegue cuidadosamente o inserto Transwell, inverta-o e coloque-o em um poço pré-preenchido na placa de 24 poços. Para remover o meio dos poços, segure o inserto Transwell com firmeza e aspire com uma pipeta P200 através das pequenas aberturas nas laterais. Depois de remover a mídia, enquanto ainda segura o Transwell no lugar, adicione lentamente um mililitro de mídia fresca ao longo da parede lateral do poço.
Visão Geral
Este estudo aborda o desafio de isolar adipócitos maduros de diversos depósitos de gordura sob diferentes condições dietéticas. Apresenta um protocolo escalonável que permite a análise funcional dessas células delicadas, essenciais para compreender seu papel na obesidade e em outras doenças.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Biologia dos adipócitos
- Pesquisa em obesidade
- Técnicas de isolamento celular
Contexto
- Os adipócitos maduros são grandes e frágeis
- Os métodos padrão de isolamento muitas vezes são ineficazes
- A caracterização do depósito adiposo varia conforme as influências dietéticas
Métodos Utilizados
- Isolamento de adipócitos maduros utilizando colagenase e DNase
- Modelo de estudo ex vivo com células murinas
- Protocolo escalonável adaptável a diferentes condições dietéticas e sexos
Principais Resultados
- Adipócitos maduros isolados com sucesso que refletem as características in vivo
- Metodologia otimizada para diversos tecidos adiposos
- O protocolo permite cultivo e imagem adicionais para estudos funcionais
Conclusões
- O estudo fornece um protocolo confiável para a pesquisa de adipócitos
- Amplia a compreensão da função dos adipócitos na saúde e na doença
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O isolamento e cultivo confiáveis de adipócitos primários de modelos magros e obesos resolvem um gargalo crítico na pesquisa de doenças metabólicas e na validação de alvos. Este protocolo permite a investigação funcional da biologia do adipócito, apoiando a redução de riscos mecanicistas e a continuidade translacional em modelos de doenças induzidas pela obesidade. A abordagem aumenta a confiança preditiva em programas de descoberta precoce e pré-clínicos voltados para a função do tecido adiposo e sinalização endócrina.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite análise funcional direta de adipócitos maduros provenientes de depósitos adiposos distintos e estados alimentares.
- Auxilia na redução de riscos mecanicistas ao preservar perfis transcricionais e funcionais semelhantes aos in vivo.
- Facilita a verificação de hipóteses sobre mecanismos de doenças impulsionados por adipócitos e a comunicação intercelular.
- Aprimora a confiabilidade preditiva na seleção de alvos em pesquisas metabólicas e endócrinas.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Fornece sistemas validados de adipócitos primários para ensaios de co-cultivo e lipólise posteriores.
- Permite a preparação reprodutível de meio condicionado por adipócitos para análise do secretoma.
- Apoia a padronização e escalabilidade de ensaios em modelos magros e obesos, masculinos e femininos.
- Prepara plataformas robustas para triagem de compostos e leituras funcionais.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha descobertas in vitro com a biologia do tecido adiposo relevante para doenças a partir de modelos pré-clínicos.
- Permite a continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica de intervenções direcionadas aos adipócitos.
- Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco ao espelhar a função dos adipócitos in vivo.
- Facilita a descoberta de biomarcadores por meio da análise de fatores secretados pelos adipócitos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo se integra ao continuum de descoberta a pré-clínico ao permitir a análise ex vivo da função de adipócitos, apoiando tanto a validação de alvos quanto a pesquisa translacional em pipelines de doenças metabólicas.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação mecanicista dos papéis dos adipócitos na doença.
- Triagem: Fornece preparações reprodutíveis de adipócitos específicas para depósitos e dietas, para o desenvolvimento de ensaios.
- Análises: Fornece resultados quantitativos para estudos de lipólise, co-cultivo e secretoma.
- Pesquisa Translacional: Conecta achados in vitro e in vivo para alinhamento de modelos pré-clínicos.
- Reutilização Empresarial: Oferece um protocolo escalável e adaptável para diversos programas de pesquisa metabólica e endócrina.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista em modelos de doenças mediadas por adipócitos.
- Valor Operacional: Padroniza o isolamento e o cultivo entre diferentes sexos, depósitos e condições dietéticas.
- Valor Estratégico: Permite decisões robustas de prosseguir ou interromper projetos e triagem eficiente do portfólio em termos de capital na pesquisa metabólica.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de programas terapêuticos direcionados a adipócitos.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em isolamento de células primárias e manipulação de adipócitos frágeis.
- Necessita de acesso à infraestrutura de cultura de tecidos e ferramentas especializadas de pipetagem.
- Exige padronização entre equipes para reprodutibilidade entre modelos e condições.
- Adapta-se a modelos murinos magros e obesos, machos e fêmeas.
- As limitações incluem a natureza delicada dos adipócitos maduros e a possível toxicidade lipídica durante o isolamento.
