Name: Isolamento e cultura de adipócitos murinos primários de camundongos magros e obesos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-24T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 34 s
Description: Aprenda a isolar adipócitos maduros de camundongos magros e obesos usando colagenase e DNase. Este protocolo escalável permite estudos funcionais ex vivo para investigar a biologia do tecido adiposo em diferentes condições dietéticas.

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<meta charset="utf8"></head><body>Cultura de adipócitos e explantes murinos para estudos funcionais e de imagem

<ol><li>Ward, Z. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projected+U.S.+state-level+prevalence+of+adult+obesity+and+severe+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Projected U.S. state-level prevalence of adult obesity and severe obesity.</a> N Engl J Med. 381 (25), 2440-2450 (2019).</li>
<li>Vishvanath, L., Gupta, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+adipogenesis+to+healthy+adipose+tissue+expansion+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Contribution of adipogenesis to healthy adipose tissue expansion in obesity.</a> J Clin Invest. 129 (10), 4022-4031 (2019).</li>
<li>Longo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+dysfunction+as+determinant+of+obesity-associated+metabolic+complications%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue dysfunction as determinant of obesity-associated metabolic complications.</a> Int J Mol Sci. 20 (9), 2358(2019).</li>
<li>Funcke, J. B., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+adiponectin+and+leptin%3A+Adipose+tissue-derived+mediators+of+inter-organ+communication%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Beyond adiponectin and leptin: Adipose tissue-derived mediators of inter-organ communication.</a> J Lipid Res. 60 (10), 1648-1684 (2019).</li>
<li>Johnston, E. K., Abbott, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+paracrine-%2C+autocrine-%2C+and+matrix-dependent+signaling+during+the+development+and+progression+of+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue paracrine-, autocrine-, and matrix-dependent signaling during the development and progression of obesity.</a> Cells. 12 (3), 407(2023).</li>
<li>Koenen, M., Hill, M. A., Cohen, P., Sowers, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity%2C+adipose+tissue+and+vascular+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Obesity, adipose tissue and vascular dysfunction.</a> Circ Res. 128 (7), 951-968 (2021).</li>
<li>Liu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+and+lipidomic+profiling+of+subcutaneous+and+visceral+adipose+tissues+in+15+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Data%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic and lipidomic profiling of subcutaneous and visceral adipose tissues in 15 vertebrates.</a> Sci Data. 10 (1), 453(2023).</li>
<li>Wu, Y., Li, X., Li, Q., Cheng, C., Zheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue-to-breast+cancer+crosstalk%3A+Comprehensive+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue-to-breast cancer crosstalk: Comprehensive insights.</a> Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 1877 (5), 188800(2022).</li>
<li>Emont, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+atlas+of+human+and+mouse+white+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single-cell atlas of human and mouse white adipose tissue.</a> Nature. 603 (7903), 926-933 (2022).</li>
<li>Nahmgoong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+properties+of+adipose+stem+cell+subpopulations+determine+fat+depot-specific+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Distinct properties of adipose stem cell subpopulations determine fat depot-specific characteristics.</a> Cell Metab. 34 (3), 458-472.e6 (2022).</li>
<li>Hildreth, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing+of+human+white+adipose+tissue+identifies+new+cell+states+in+health+and+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing of human white adipose tissue identifies new cell states in health and obesity.</a> Nat Immunol. 22 (5), 639-653 (2021).</li>
<li>Maniyadath, B., Zhang, Q., Gupta, R. K., Mandrup, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue at single-cell resolution.</a> Cell Metab. 35 (3), 386-413 (2023).</li>
<li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocytes+promote+breast+tumorigenesis+through+taz-dependent+secretion+of+resistin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Adipocytes promote breast tumorigenesis through taz-dependent secretion of resistin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (52), 33295-33304 (2020).</li>
<li>Cornide-Petronio, M. E., Jimenez-Castro, M. B., Gracia-Sancho, J., Peralta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+liver-visceral+adipose+axis+during+hepatic+resection+and+liver+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">New insights into the liver-visceral adipose axis during hepatic resection and liver transplantation.</a> Cells. 8 (9), 1100(2019).</li>
<li>Verma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc-alpha-2-glycoprotein+secreted+by+triple-negative+breast+cancer+promotes+peritumoral+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Zinc-alpha-2-glycoprotein secreted by triple-negative breast cancer promotes peritumoral fibrosis.</a> Cancer Res Commun. 4 (7), 1655-1666 (2024).</li>
<li>Min, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+repertoire+of+human+adipocyte+subtypes+develops+from+transcriptionally+distinct+mesenchymal+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Diverse repertoire of human adipocyte subtypes develops from transcriptionally distinct mesenchymal progenitor cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (36), 17970-17979 (2019).</li>
<li>Harms, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+human+white+adipocytes+cultured+under+membranes+maintain+identity%2C+function%2C+and+can+transdifferentiate+into+brown-like+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Mature human white adipocytes cultured under membranes maintain identity, function, and can transdifferentiate into brown-like adipocytes.</a> Cell Rep. 27 (1), 213-225.e5 (2019).</li>
<li>Chaurasiya, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+visceral+adipose+tissue+microvascular+endothelial+cell+isolation+and+establishment+of+co-culture+with+white+adipocytes+to+analyze+cell-cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Human visceral adipose tissue microvascular endothelial cell isolation and establishment of co-culture with white adipocytes to analyze cell-cell communication.</a> Exp Cell Res. 433 (2), 113819(2023).</li>
<li>Galmozzi, A., Kok, B. P., Saez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+differentiation+of+primary+white+and+brown+pre-adipocytes+from+newborn+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and differentiation of primary white and brown pre-adipocytes from newborn mice.</a> J Vis Exp. 167, e62005(2021).</li>
<li>Farrar, J. S., Martin, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+the+stromal+vascular+fraction+from+adipose+tissue+and+subsequent+differentiation+into+white+or+beige+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of the stromal vascular fraction from adipose tissue and subsequent differentiation into white or beige adipocytes.</a> Methods Mol Biol. 2455, 103-115 (2022).</li>
<li>You, X., Gao, J., Yao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+methods+to+mechanically+isolate+stromal+vascular+fraction%3A+A+concise+review%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Ther%22%5BJournal%5D)">Advanced methods to mechanically isolate stromal vascular fraction: A concise review.</a> Regen Ther. 27, 120-125 (2024).</li>
<li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitor+cell+isolation+from+mouse+epididymal+adipose+tissue+and+sequencing+library+construction%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Progenitor cell isolation from mouse epididymal adipose tissue and sequencing library construction.</a> STAR Protoc. 4 (4), 102703(2023).</li>
<li>Cho, D. S., Doles, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+adipose+progenitor+cells+from+mouse+epididymal+adipose+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of adipose progenitor cells from mouse epididymal adipose tissues.</a> J Vis Exp. 162, e61694(2020).</li>
<li>Lauschke, V. M., Hagberg, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+human+adipose+tissue+culture+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Next-generation human adipose tissue culture methods.</a> Curr Opin Genet Dev. 80, 102057(2023).</li>
<li>Alexandersson, I., Harms, M. J., Boucher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+human+mature+adipocytes+using+membrane+mature+adipocyte+aggregate+cultures+%28MAAC%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of human mature adipocytes using membrane mature adipocyte aggregate cultures (MAAC).</a> J Vis Exp. 156, e60485(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>100x Solução Poloxamer 188</td><td>Sigma</td><td>P5556-100mL</td><td></td></tr><tr><td>15 mL cônico</td><td>Cellstar</td><td>188261</td><td></td></tr><tr><td>21 G Agulha</td><td>BD</td><td>305165</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 5 mL</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>50 mL</td><td>Cônico Cellstar</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>6,5 mm Transwell com 0,4 &micro; m Inserção de membrana de policarbonato de poros</td><td>Corning</td><td>3413</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016-500gm</td><td></td></tr><tr><td>CellMask Manchas de membrana de plasma</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10045</td><td></td></tr><tr><td>CL 316243 sal dissódico</td><td>Tocris</td><td>1499</td><td></td></tr><tr><td>Pó de colagenase</td><td>Sigma</td><td>C6885</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11995-040</td><td></td></tr><tr><td>DMEM sem pheonol Red</td><td>Gibco</td><td>A14430-01</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>A56708-01</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Tissue Path Superfrost Plus Gold Slides</td><td>Fisher científico</td><td></td><td></td>Ponta</tr> de <tr><td>Pipeta de Carregamento de Gel</td> 1518848 <td>Fisher scientific</td><td>02-707-181</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Ensaio de Glicerol</td><td>Solução Salar</td> Balanceada Abcam <td>AB133130</td><td></td></tr><tr><td>Hanks (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Buffer</td><td>Sigma</td><td>83264-100ml-F</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Centrífuga Megafuge 16R</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>75004271</tr><tr><td>Hoechst 33342 Solução</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Mini Agitador Incubador</td><td>VWR</td><td>12620-942</td><td></td></tr><tr><td>Médio 199</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4530</td><td></td></tr><tr><td>Óculos de Cobertura para Microscópio</td><td>VWR</td><td>16004-302</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Espaçadores de Imagem SecureSeal Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Grace Biolabs</td><td>654006</td><td></td></tr><tr><td>Seive (Coador de Coquetel de Malha Fina SteeL)</td><td>OXO</td><td>3112000</td><td>https://www.oxo.com/steel-fine-mesh-cocktail-strainer-660.html</td></tr></tbody></table>

isolamento e cultura de adipócitos murinos primários de camundongos magros e obesos

Isolation and Culturing of Primary Murine Adipocytes from Lean and Obese Mice

Como mostrado na Figura 2, a moagem adequada (Figura 2B) e a digestão (Figura 2C) são importantes para o isolamento de adipócitos maduros intactos. A sub-picagem e a subdigestão podem resultar em um baixo rendimento de adipócitos maduros devido à separação inadequada do tecido conjuntivo. Visualmente, isso pode ser observado com o tecido fibroso remanescente após a picagem e aglomerados visíveis na solução de colagenase. Além disso, a picagem excessiva e a digestão excessiva também resultam em baixo rendimento devido ao estouro dos adipócitos maduros. Visualmente, isso resulta na perda da camada opaca branca e no acúmulo de uma camada lipídica grande, clara e livre. Níveis inadequados de picagem ou digestão resultarão em isolamento deficiente dos adipócitos.
A preparação e digestão adequadas do tecido adiposo resultarão na separação do tecido em quatro camadas distintas, como visto na Figura 3. Algum estouro dos adipócitos, resultando na liberação de lipídios livres, é inevitável; no entanto, a picada e a digestão adequadas garantirão a ruptura mínima dos adipócitos. A camada lipídica livre restante e o meio serão removidos durante o empacotamento dos adipócitos (Figura 4). O empacotamento adequado dos adipócitos é essencial para o isolamento eficiente dos adipócitos maduros. Quaisquer lipídios ou meios livres restantes resultarão em isolamento deficiente e afetarão negativamente os ensaios funcionais a jusante, como plaqueamento, lipólise e imagens celulares.
Este protocolo gera uma preparação limpa de adipócitos maduros. Ensaios de imagem celular e lipólise podem ser realizados para avaliar a função celular e demonstrar que os adipócitos maduros mantêm a função após o isolamento e após a cultura por até duas semanas. O ensaio de lipólise indica que os adipócitos maduros mantêm a capacidade de responder à sinalização celular através da liberação de glicerol livre após a estimulação do receptor adrenérgico β-3 (Figura 6A, B). Essa capacidade é mantida mesmo após 2 semanas em cultura e é altamente comparável à atividade de lipólise de explantes de tecido adiposo cultivados por 24 h ( Figura 6C , D ). Os adipócitos de baixa qualidade apresentarão lipólise atenuada. A imagem celular de adipócitos isolados mostra adipócitos maduros uniloculares redondos e intactos contendo uma única gotícula lipídica grande. Isolamentos de adipócitos de baixa qualidade mostrarão principalmente gotículas de óleo extracelulares grandes indicativas de adipócitos estourados.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67846/67846fig01.jpg"> 
Figura 1: Incorporação de explantes de tecido adiposo. (A) Imagem da cúpula da matriz da membrana basal parcialmente solidificada antes da incorporação do tecido. (B) Imagens representativas de incorporação inadequada e adequada de tecidos. A incorporação inadequada é visível, pois o tecido parece flutuar parcial ou completamente acima da cúpula. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67846/67846fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67846/67846fig02.jpg"> 
Figura 2: Esquema de picagem e digestão adequadas do tecido adiposo. (A) Representação esquemática das etapas de picagem e digestão do tecido 4.2-4.6. (B) Imagens representativas de tecido sub, ótimo e superpicado. O tecido subpicado tem grandes pedaços que mantêm sua forma original. O tecido picado em excesso resulta em um aumento visível nos lipídios livres ao redor do tecido, que parecem claros e oleosos. (C) Imagens representativas de tecido sub, ótimo e superdigerido. O tecido subdigerido contém pedaços de tecido inteiro remanescentes na solução. O tecido superdigerido exibe uma grande camada lipídica livre que se separa rapidamente da solução. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67846/67846fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67846/67846fig03.jpg"> 
Figura 3: Separação das camadas de tecido adiposo digerido. (A) Imagem esquemática e representativa das camadas que estão presentes seguindo a etapa 5.3. (B) Uso de uma ponta de pipeta cortada para remover a camada de adipócitos maduros do tubo cônico de 50 mL. (C) Técnica e colocação adequadas da agulha e seringa para remover os meios de cultura abaixo da camada de adipócitos maduros. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67846/67846fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67846/67846fig04.jpg"> 
Figura 4: Empacotamento seqüencial de adipócitos maduros. Imagens sequenciais do empacotamento dos adipócitos maduros. Camadas de lipídios livres, adipócitos e meios são marcados. Após cada centrifugação, os lipídios e meios livres são removidos. Isso é repetido até que nenhum meio ou lipídios livres se separem dos adipócitos após uma centrifugação. A imagem final é representativa de adipócitos maduros bem compactados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67846/67846fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67846/67846fig05.jpg"> 
Figura 5: Plaqueamento e cultura de adipócitos maduros. (A) Esquema do plaqueamento de adipócitos maduros. Usando uma ponta de pipeta p200 cortada, os adipócitos compactados são colocados na membrana de uma inserção de cultura de células. A pastilha é então invertida em poços pré-cheios de meios de cultura. (B) Uma imagem representativa de adipócitos maduros de chapeamento representando adipócitos depositadores de ponta de pipeta cortada na inserção transwell. (C) Esquemas e imagens representativas de adipócitos adequadamente embalados e mal embalados revestidos com transwells, vistos de cima dos poços. Os adipócitos adequadamente compactados parecem brancos e opacos, enquanto os adipócitos mal compactados resultam na formação de gotículas lipídicas claras. (D) Esquema da técnica usada para mudar os meios de cultura. Uma ponta de pipeta p200 é usada para remover cuidadosamente o meio através das aberturas na parede lateral do inserto do transwell. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67846/67846fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67846/67846fig06.jpg"> 
Figura 6: Imagem de adipócitos maduros e ensaio de lipólise. (A, B) Liberação de glicerol dos adipócitos maduros subcutâneos (A) e viscerais (B). Os adipócitos foram isolados de camundongos machos C57BL/6 de 16 semanas de idade alimentados com uma dieta normal de ração. 30 μL de adipócitos foram plaqueados conforme descrito na etapa 7.1 e cultivados por 1 ou 10 dias. Os adipócitos foram tratados com 5 μM de CL-316.243 por 1 h, 2 h e 4 h, e os sobrenadantes foram coletados e analisados para glicerol livre. (C, D) Liberação de glicerol a partir de explantes de tecido adiposo subcutâneo (C) e visceral (D). O tecido adiposo foi isolado de camundongos fêmeas C57BL/6 de 18 semanas de idade alimentados com uma dieta normal. 0,1 g de explantes de tecido adiposo foram plaqueados conforme descrito nas etapas 3.1-3.4 e cultivados por 24 h. Os adipócitos foram tratados com 5 μM de CL-316.243 por 1 h, 2 h e 4 h, e os sobrenadantes foram coletados e analisados para glicerol livre. N = 3 réplicas técnicas para A-D. Todos os dados são média ± desvio padrão. (E) Imagens representativas de adipócitos maduros subcutâneos e viscerais isolados. Os adipócitos foram isolados de camundongos machos C57BL / 6J de 16 semanas alimentados com uma dieta normal. Os adipócitos foram corados com coloração de membrana plasmática (vermelho) e coloração de núcleos de Hoechst (azul). Barras de escala: 50 μm; Ampliação: 60x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67846/67846fig06large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sexo</td>
			<td>Dieta</td>
			<td>Depósito</td>
			<td>Dificuldade de picar</td>
			<td>Colagenase: proporção de tecido</td>
			<td>Tempo de digestão sugerido (min)</td>
			<td>Temperatura de rotação.</td>
			<td>Temperatura de lavagem.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">Fêmea</td>
			<td rowspan="2">Ração normal</td>
			<td>Subcutâneo</td>
			<td>Duro</td>
			<td>2:1</td>
			<td>12</td>
			<td>RT</td>
			<td>37 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visceral</td>
			<td>Média</td>
			<td>1:1</td>
			<td>8</td>
			<td>RT</td>
			<td>37 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Dieta rica em gordura</td>
			<td>Subcutâneo</td>
			<td>Fácil</td>
			<td>1:1</td>
			<td>8</td>
			<td>RT</td>
			<td>37 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visceral</td>
			<td>Fácil</td>
			<td>1:1</td>
			<td>8</td>
			<td>RT</td>
			<td>37 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">Macho</td>
			<td rowspan="2">Ração normal</td>
			<td>Subcutâneo</td>
			<td>Duro</td>
			<td>2:1</td>
			<td>14</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visceral</td>
			<td>Média</td>
			<td>1:1</td>
			<td>10</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Dieta rica em gordura</td>
			<td>Subcutâneo</td>
			<td>Fácil</td>
			<td>1:1</td>
			<td>10</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visceral</td>
			<td>Fácil</td>
			<td>1:1</td>
			<td>10</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Sexo, depósito e modificações específicas da dieta. A dificuldade de picar de cada tecido, descrita como "Fácil", "Média" ou "Dura" em relação a outros depósitos. Observe que o tempo real de picagem varia de acordo com o pesquisador e o tecido. Colagenase: Proporção de tecido listada como volume (mL) de solução de colagenase + DNase preparada na etapa 4.1 para o peso do tecido (g). O tempo de digestão é uma estimativa aproximada, mas o tempo real de digestão varia de acordo com a picagem e o tecido. Os pesquisadores devem avaliar a digestão conforme descrito no protocolo. A temperatura de centrifugação e a temperatura de lavagem diferem entre camundongos machos e fêmeas. RT denota temperatura ambiente.

Isolamento e cultura de adipócitos murinos primários de camundongos magros e obesos

Adipose tissue is primarily composed of mature, lipid-laden adipocytes by volume. These postmitotic cells play a critical role in energy storage and ...

Nossa pesquisa se concentra em investigar a função de adipócitos maduros de diferentes depósitos de gordura e condições dietéticas. Estamos especificamente interessados em entender como os adipócitos maduros se comunicam com as células circundantes e como essa conversa cruzada pode influenciar a progressão da doença e ser alterada na obesidade. Os adipócitos maduros são células grandes e delicadas, o que torna os métodos de isolamento celular comumente usados, como o FACS, ineficazes.Além disso, altos níveis de lipídios livres frequentemente encontrados no tecido adiposo podem ser tóxicos para os adipócitos maduros, complicando sua manutenção. Em contraste com os métodos comumente usados que dependem da diferenciação in vitro de pré-adipócitos, este protocolo nos permite estudar adipócitos isolados ex vivo, que são funcional e transcricionalmente semelhantes aos adipócitos in vivo. Isso é particularmente importante, pois os adipócitos variam muito entre os depósitos de gordura e em diferentes condições de dieta.Este protocolo isola eficientemente, espelhando adipócitos maduros e é facilmente escalável. Ajustes são incluídos para otimizar o isolamento de adipócitos de camundongos de diferentes sexos e com diferentes condições alimentares. Uma vez isolados, os adipócitos podem ser cultivados, fotografados ou usados conforme necessário.Para começar, prepare uma solução de colagenase com DNase adicionando 0,00017 gramas de DNase por um mililitro de solução de colagenase e vortex a mistura para garantir a mistura completa. Usando uma lâmina de barbear, pique o tecido adiposo dos camundongos isolados até que pareça homogêneo. Em seguida, transfira o tecido picado para um tubo cônico estéril de 50 mililitros.Adicione a solução preparada de colagenase e DNase ao tecido adiposo picado e ao vórtice na velocidade máxima por sete a 10 segundos para misturar bem os componentes. Em seguida, coloque os tubos cônicos de 50 mililitros horizontalmente em um agitador ajustado para 220 RPM a 37 graus Celsius por 10 minutos. Após a incubação, remova os tubos, vortex por cinco segundos e verifique as amostras.Agora, usando uma pipeta sorológica, passe o tecido digerido por uma peneira para um novo tubo cônico estéril de 50 mililitros. Adicione FBS igual ao volume de tecido e solução de colagenase através da peneira no mesmo tubo cônico para neutralizar a colagenase. Gire os tubos a 300 G por três minutos na temperatura especificada na tabela mostrada aqui.Em seguida, usando uma pipeta de 200 microlitros, descarte cuidadosamente a camada superior de lipídios livres. Em seguida, use uma pipeta P1000 com a ponta cortada para transferir os adipócitos maduros para um tubo preparado de 15 mililitros contendo 10 mililitros de meio de crescimento. Inverta suavemente os tubos de 15 mililitros contendo adipócitos maduros três a cinco vezes até que a camada branca se disperse por todo o meio.Depois de descansar os tubos por 10 minutos, gire-os na temperatura previamente determinada para separar ainda mais as camadas. Depois disso, use uma pipeta para descartar a camada superior de lipídios livres. Agora conecte uma agulha de calibre 21 a uma seringa de cinco mililitros e deslize cuidadosamente a agulha pela borda do tubo até que a parte inferior da agulha esteja abaixo da camada do local dos adipócitos maduros.Em seguida, puxe lentamente a seringa para remover o meio de cultura e quaisquer detritos celulares. Adicione suavemente 10 mililitros de meios de cultura ao tubo. Usando pontas de pipeta de carregamento de gel Deslize a ponta para baixo na borda do tubo para remover o meio restante abaixo da camada de adipócitos maduros.Em seguida, centrifugue as células a 100 G durante um minuto. Usando uma pipeta, remova os lipídios livres. Usando uma ponta de pipeta de carregamento de gel, remova o meio de cultura abaixo dos adipócitos.Remova as inserções de cultura de células de uma placa de 24 poços tratada com cultura de tecidos e coloque-as com a membrana voltada para cima na superfície do capuz. Encha os poços alternados da placa com meios de cultura quentes. Usando uma ponta de pipeta P200 cortada, transfira 30 microlitros de adipócitos maduros embalados para o topo de uma inserção Transwell.Em seguida, pegue cuidadosamente o inserto Transwell, inverta-o e coloque-o em um poço pré-preenchido na placa de 24 poços. Para remover o meio dos poços, segure o inserto Transwell com firmeza e aspire com uma pipeta P200 através das pequenas aberturas nas laterais. Depois de remover a mídia, enquanto ainda segura o Transwell no lugar, adicione lentamente um mililitro de mídia fresca ao longo da parede lateral do poço.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Devido à conexão drástica e negativa entre a obesidade e outras comorbidades, a investigação sobre o papel adiposo desempenha na doença e na saúde global é garantido. Apresenta-se um protocolo para o isolamento e a excisão de depósitos adiposos que permitam o estudo de tecido adiposo usando in situ e in vitro.

Localização, identificação e excisão de Depots Murino adiposo

A cultura agregada madura de membrana (MAAC) é um novo método para cultivar adipócitos humanos maduros. Aqui detalhamos como isolar adipócitos do adipose humano e como configurar o MAAC.

Isolamento e Cultura de Adipócitos Maduros Humanos Usando culturas agregadas de adipócitomaduros de membrana (MAAC)

Este protocolo descreve a abordagem técnica para isolar subpopulações de células estromais adipogênicas e fibroinflamatórias de depósitos de tecido adiposo branco intra-abdominal murino (WAT) por classificação de células ativadas por fluorescência ou separação de esferas imunomagnéticas.

Isolamento de Subpopulações de Células Estromais Adipogênicas e Fibro-Inflamatórias de Depósitos Adiposos Intra-Abdominais Murinos

Este relatório descreve um protocolo para o isolamento simultâneo de preadipócitos primários marrons e brancos de camundongos recém-nascidos. Células isoladas podem ser cultivadas na cultura e induzidas a se diferenciar em adipócitos brancos e marrons totalmente maduros. O método permite a caracterização genética, molecular e funcional das células de gordura primárias na cultura.

Isolamento e diferenciação de preadipócitos brancos e marrons primários de camundongos recém-nascidos

Este estudo descreve um novo método de isolamento de adipócitos marrons murinos para análise da expressão gênica e proteica.

Isolando Adipócitos Castanhos do Tecido Adiposo Castanho Interescapular Murino para Análise da Expressão Gênica e Proteica

Este protocolo descreve o isolamento de pré-adipócitos de camundongos da gordura subcutânea, sua diferenciação em adipócitos maduros e a indução de resistência à insulina. A ação da insulina é avaliada pela fosforilação/ativação de membros da via de sinalização da insulina através do western blot. Este método permite a determinação direta da resistência/sensibilidade à insulina em adipócitos primários.

Adipócitos diferenciados de camundongos em cultura primária: um modelo de resistência à insulina

Descrevemos o isolamento, a cultura e a indução adipogênica de pré-adipócitos derivados da fração vascular estromal do tecido adiposo periaórtico de camundongos, permitindo o estudo da função do tecido adiposo perivascular e sua relação com as células vasculares.

Isolamento, Cultura e Indução Adipogênica de Pré-adipócitos Derivados da Fração Vascular Estromal do Tecido Adiposo Periaórtico de Camundongos

Usando um modelo explantado ex vivo , pequenos pedaços da porção rostral do tecido adiposo branco visceral de camundongos magros são cultivados por 7 a 10 dias, permitindo a indução e o estudo da inflamação do tecido adiposo conforme ocorre durante a alimentação rica em gordura.

Um modelo de camundongo ex vivo para inflamação do tecido adiposo com dieta rica em gordura

Aqui, nós descrevemos um protocolo para isolamento e cultura de células endoteliais pulmonares de camundongos. Este método compreende mecânico e dissociação enzimática do tecido pulmonar, bem como um processo de purificação passo 2, utilizando anti-PECAM-1 e anti-ICAM-2 anticorpos conjugados com esferas magnéticas, que produz uma população de células endoteliais pura de origem principalmente microvascular.

Isolamento e cultura de células endoteliais pulmonares de camundongos Neonatal

Neste relatório, nós descrevemos um protocolo para o isolamento de populações altamente purificados de leucócitos que infiltram tumores. Este protocolo é adaptado a partir do Biotech Miltenyi protocolo para aumentar o rendimento e grau de pureza para o isolamento de células a partir de tecido de tumor complexo.

Isolamento de células imunes de tumores primários

Aprenda a isolar adipócitos maduros de camundongos magros e obesos usando colagenase e DNase. Este protocolo escalável permite estudos funcionais ex vivo para investigar a biologia do tecido adiposo em diferentes condições dietéticas.

Isolamento e cultura de adipócitos murinos primários de camundongos magros e obesos

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