Name: Medição de citometria de fluxo de alto rendimento do mecanótipo celular com base na ruptura e entrega de sondas de tensão de DNA nas células (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-13T12:35:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Aprenda a medir forças de tração celular por citometria de fluxo de alto rendimento usando sondas de DNA imobilizadas. Este método avança a compreensão da mecanobiologia e auxilia no desenvolvimento de mecanoterapêuticos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Puleo, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensing+during+directed+cell+migration+requires+dynamic+actin+polymerization+at+focal+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanosensing during directed cell migration requires dynamic actin polymerization at focal adhesions.</a> J Cell Biol. 218 (12), 4215-4235 (2019).</li>
<li>He, L., Ahmad, M., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensitive+channels+and+their+functions+in+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanosensitive channels and their functions in stem cell differentiation.</a> Exp Cell Res. 374 (2), 259-265 (2019).</li>
<li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensing+drives+acuity+of+%CE%B1%CE%B2+T-cell+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Mechanosensing drives acuity of αβ T-cell recognition.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 114 (39), E8204-E8213 (2017).</li>
<li>Kai, F., Laklai, H., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+matters%3A+Biomechanical+regulation+of+cell+invasion+and+migration+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Force matters: Biomechanical regulation of cell invasion and migration in disease.</a> Trends Cell Biol. 26 (7), 486-497 (2016).</li>
<li>Chapman, M., Rajagopal, V., Stewart, A., Collins, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+review+of+single-cell+mechanotyping+approaches+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Critical review of single-cell mechanotyping approaches for biomedical applications.</a> Lab Chip. 24 (12), 3036-3063 (2024).</li>
<li>Swaminathan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stiffness+grades+metastatic+potential+in+patient+tumor+cells+and+in+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanical stiffness grades metastatic potential in patient tumor cells and in cancer cell lines.</a> Cancer Res. 71 (15), 5075-5080 (2011).</li>
<li>Graybill, P. M., Bollineni, R. K., Sheng, Z., Davalos, R. V., Mirzaeifar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+constriction+channel+analysis+of+astrocytoma+stiffness+and+disease+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">A constriction channel analysis of astrocytoma stiffness and disease progression.</a> Biomicrofluidics. 15 (2), 024103(2021).</li>
<li>Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+traction+stresses+increase+with+increasing+metastatic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential.</a> PLoS One. 7 (2), e32572(2012).</li>
<li>Yasunaga, A., Murad, Y., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+molecular+tension-classifications%2C+interpretations+and+limitations+of+force+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors.</a> Phys Biol. 17 (1), 011001(2019).</li>
<li>Liu, Y., Galior, K., Ma, V. P. -Y., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+tension+probes+for+imaging+forces+at+the+cell+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Acc+Chem+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular tension probes for imaging forces at the cell surface.</a> Acc Chem Res. 50 (12), 2915-2924 (2017).</li>
<li>Pawlak, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAD-TGTs%3A+high-throughput+measurement+of+cellular+mechanotype+via+rupture+and+delivery+of+DNA+tension+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">RAD-TGTs: high-throughput measurement of cellular mechanotype via rupture and delivery of DNA tension probes.</a> Nat. Commun. 14 (1), 2468(2023).</li>
<li>Wang, X., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+single+molecular+forces+required+to+activate+integrin+and+notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Defining single molecular forces required to activate integrin and notch signaling.</a> Science. 340 (6135), 991-994 (2013).</li>
<li>Jo, M. H., Cottle, W. T., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+measurement+of+molecular+tension+during+cell+adhesion+and+migration+using+multiplexed+differential+analysis+of+tension+gauge+tethers%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomater+Sci+Eng%22%5BJournal%5D)">Real-time measurement of molecular tension during cell adhesion and migration using multiplexed differential analysis of tension gauge tethers.</a> ACS Biomater Sci Eng. 5 (8), 3856-3863 (2019).</li>
<li>Tompkins, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+underpinnings+of+ssDNA+specificity+by+Rep+HUH-endonucleases+and+implications+for+HUH-tag+multiplexing+and+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular underpinnings of ssDNA specificity by Rep HUH-endonucleases and implications for HUH-tag multiplexing and engineering.</a> Nucleic Acids Res. 49 (2), 1046-1064 (2021).</li>
<li>Lovendahl, K. N., Hayward, A. N., Gordon, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-Directed+Covalent+Protein-DNA+Linkages+in+a+Single+Step+Using+HUH-Tags%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Sequence-Directed Covalent Protein-DNA Linkages in a Single Step Using HUH-Tags.</a> J Am Chem Soc. 139 (20), 7030-7035 (2017).</li>
<li>Kim, K. A., Vellampatti, S., Hwang, S. H., Kim, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-based+single+molecule+force+sensor+for+characterization+of+%CE%B1+5+%CE%B2+1+integrin+tension+required+for+invadopodia+formation+and+maturation+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Funct+Mater%22%5BJournal%5D)">DNA-based single molecule force sensor for characterization of α 5 β 1 integrin tension required for invadopodia formation and maturation in cancer cells.</a> Adv Funct Mater. 32 (28), 2110637(2022).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+molecular+tension+within+motile+focal+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Integrin molecular tension within motile focal adhesions.</a> Biophys J. 109 (11), 2259-2267 (2015).</li>
<li>Ma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanocytometry+using+tension-activated+cell+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanocytometry using tension-activated cell tagging.</a> Nat Methods. 20 (11), 1666-1671 (2023).</li>
<li>Pal, K., Zhao, Y., Wang, Y., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitous+membrane-bound+DNase+activity+in+podosomes+and+invadopodia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ubiquitous membrane-bound DNase activity in podosomes and invadopodia.</a> J Cell Biol. 220 (7), e202008079(2021).</li>
<li>Kim, K. A., Vellampatti, S., Kim, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+integrin+molecular+tension+of+human+breast+cancer+cells+on+anisotropic+nanopatterns%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Characterization of integrin molecular tension of human breast cancer cells on anisotropic nanopatterns.</a> Front Mol Biosci. 9, 825970(2022).</li>
<li>Wang, Y., Zhao, Y., Sarkar, A., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sensor+revealed+abnormal+nuclease+spatial+activity+on+cancer+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Optical sensor revealed abnormal nuclease spatial activity on cancer cell membrane.</a> J Biophotonics. 12 (5), e201800351(2019).</li>
<li>Zhao, Y., Sarkar, A., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+nucleic+acid+based+tension+sensor+for+cellular+force+imaging+with+strong+DNase+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Peptide nucleic acid based tension sensor for cellular force imaging with strong DNase resistance.</a> Biosens Bioelectron. 150, 111959(2020).</li>
<li>Rashid, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-covalent+nuclease-resistant+and+hydrogel-tethered+DNA+hairpin+probes+map+pN+cell+traction+forces%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Mater+Interfaces%22%5BJournal%5D)">All-covalent nuclease-resistant and hydrogel-tethered DNA hairpin probes map pN cell traction forces.</a> ACS Appl Mater Interfaces. 15 (28), 33362-33372 (2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Tubo Cônico de 15 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td></td></tr><tr><td>Placa de fundo de vidro de 96 poços Placa PCR</td> adesiva <td>Cellvis</td><td>P96-1.5H-N</td><td></td></tr><tr><td>Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>AB-0626</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Apex Produtos de Biopesquisa&nbsp;</td><td>25-530</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad Coluna de 20 mL</td><td>Bio-Rad</td><td>7321010</td><td></td></tr><tr><td>Biotinilada BSA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>29130</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3) Competente E. coli</td><td>New England Biolabs</td><td>C2527H</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Incubadora de cultura de células BP9703100</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Centrífuga</td><td>51030284</td><td></td>Científica</tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75009521</td><td></td></tr><tr><td>CHO-K1</td><td>ATCC</td><td>CCL-61</td><td></td></tr><tr><td>Tubulação de diálise</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI88242</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S311-100</td><td></td></tr><tr><td>Flow Citômetro</td><td>BD</td><td>Accuri C6 Plus</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo&nbsp;</td><td>BD</td><td>FlowJo v10.10</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>O3196-500</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>IBI Scientific</td><td>IB02125</td><td></td></tr><tr><td>LB agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1425-500</td><td></td></tr><tr><td>Ligante Stand</td><td>Tecnologias integradas de DNA</td><td>oligo projetado</td> <td>pelo usuárioGCT ATA AAC TCA CCG TAA TTT TTT GGC CCG CAG CGA CCA CCC TTT /3Cy5Sp/</td></tr><tr><td>Lysogeny Broth (LB)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M87-100</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Proteína NeutrAvidina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Nickel-NTA resina&nbsp;</td>Placa de Petri <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88222</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>25384-342</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Iodeto de Propídio</td><td>Cayman Chemicals</td><td>10008351</td><td></td></tr><tr><td>gel SDS-PAGE</td><td>Bio-Rad</td><td>4561096</td><td></td></tr><tr><td>Serum Free Media</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A4124801</td><td>Gibco Optimem Usado, meios alternativos sem soro são bons para usar</td></tr><tr><td>Cordão de Ancoragem</td><td>de Corte Tecnologias integradas de DNA</td><td>oligo</td><td>/5IAbRQ//iBiodT/G GGT GGT CGC TGC GGG CC</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15-345-139</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr>Filtro ultracentrífugo <td>Trypin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12605036</td><td></td></tr>, <tr><td>corte de 10 kDa</td><td>Amikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Descompactando Anchor Strand</td><td>Tecnologias integradas de DNA</td><td>projetadas pelo usuário oligo</td> <td>/ 5IAbRQ / GG GTG GTC GCT GCG GGC C / 3Bio /</td></tr> <tr><td>WDV Plasmídeo</td><td>AddGene</td><td>226983</td><td></td></tr><tr><td>WDV-Equistatina Plasmídeo</td><td>AddGene</td><td>226985</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1049</td><td>Reconstituído em DMSO</td></tr></tbody></table>

medição de citometria de fluxo de alto rendimento do mecanótipo celular com base na ruptura e entrega de sondas de tensão de dna nas células

High-throughput Flow-cytometry Measurement of Cellular Mechanotype Based on Rupture and Delivery of DNA Tension Probes into Cells

Para demonstrar a utilidade e facilidade de uso dos RAD-TGTs, analisamos os efeitos dos inibidores da Rho Quinase (ROCK) no mecanótipo das células CHO-K1. A via ROCK está envolvida na organização da actina e na ativação da miosina. Estudos anteriores usando TGTs mostraram que a inibição de ROCK diminui a ruptura de TGTs de cisalhamento 16,17,18. Os TGTs de cisalhamento ou de alta força relatam as forças contráteis exercidas por ...

Medição de citometria de fluxo de alto rendimento do mecanótipo celular com base na ruptura e entrega de sondas de tensão de DNA nas células

Mechanical forces guide many critical cellular processes, and cellular mechanical phenotype, or mechanotype, is disrupted in many diseases. The most ...

high-throughput-flow-cytometry-measurement-cellular-mechanotype-based

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

O vídeo demonstra um método para avaliar as forças do receptor aplicadas por células imunes usando nanopartículas de ouro ancoradas em polietilenoglicol e sondas de tensão de gancho de cabelo de DNA. As interações de células T CD8-positivas desencadeiam o desdobramento da sonda, emitindo fluorescência enquanto as fitas de bloqueio sustentam o sinal para quantificar as forças aplicadas pelas células imunes.

Usando sondas de tensão baseadas em DNA para avaliar as forças receptoras aplicadas pelas células imunes

Citometria de fluxo e de Complementação de fluorescência Bimolecular fornece um método quantitativo de alto rendimento para estudar a interação proteína-proteína. Esta metodologia pode ser aplicada ao mapeamento de locais de ligação de proteína e para o rastreio de factores que regulam a interacção proteína-proteína.

Citometria de fluxo e de Complementação de fluorescência Bimolecular: A alta taxa de transferência método quantitativo para estudo de interação proteína-proteína

Nós demonstramos um ensaio baseado em microfluídica para medir a escala de tempo para que as células de trânsito através de uma seqüência de constrições em escala mícron.

A técnica de microfluídica para sondar Deformabilidade celular

Neste protocolo, descrevemos um método de micropipeta para aplicar directamente uma força controlada para o núcleo de uma célula viva. Este ensaio permite interrogatório das propriedades mecânicas nucleares na célula viva, aderente.

Uma sonda de força direta para medir a integração mecânica entre o núcleo e o citoesqueleto

Aqui, apresentamos um protocolo para a utilização simultânea de ressonância Förster, sensores de tensão baseados na transferência de energia para medir proteína carga e fluorescência recuperação após fotobranqueamento para medir a dinâmica da proteína, permitindo a medição de força-sensível dinâmica da proteína dentro de células vivas.

Medição da dinâmica de força-sensível da proteína em células vivas, usando uma combinação de técnicas fluorescentes

O método apresentado combina a análise quantitativa das rupturas da dobro-Costa do ADN (DSBs), a distribuição do ciclo de pilha e o apoptose para permitir a avaliação ciclo-específica da pilha da indução e do reparo de DSB assim como as conseqüências da falha do reparo.

Medição específica do ciclo celular de γH2AX e apoptose após estresse genotóxico por citometria de fluxo

As forças mecânicas são importantes para controlar a migração celular. Este protocolo demonstra o uso de hidrogéis elásticos que podem ser deformados usando uma micropipeta de vidro e um micromanipulador para estimular as células com um gradiente de rigidez local para provocar mudanças na estrutura celular e migração.

Ensaio de Durotaxis de célula única para avaliar o controle mecânico do movimento celular e eventos de sinalização relacionados

Aqui apresentamos um protocolo para células de micropattern em resolução unicelular usando a adesão programada pelo DNA. Este protocolo usa uma plataforma de fotolitografia benchtop para criar padrões de oligonucleotídeos de DNA em um slide de vidro e, em seguida, rotula membranas celulares com oligonucleotídeos complementares disponíveis comercialmente. A hibridização dos oligos resulta em adesão celularprogramada.

Padronização simples, acessível e modular de células usando DNA

Este artigo descreve um protocolo detalhado para o uso de sondas de tensão baseadas em DNA para obter imagens das forças receptoras aplicadas por células imunes. Essa abordagem pode mapear forças receptoras &gt;4.7pN em tempo real e pode integrar forças ao longo do tempo.

Sondas de Tensão de DNA para Mapear as Forças Transitórias do Receptor de Piconewton por Células Imunes

O presente protocolo fornece uma solução prática que permite a medição de apoptose, potencial de membrana mitocondrial e danos ao DNA em espermatozoides humanos com um único citômetro.

Análise por Citometria de Fluxo de Biomarcadores para Detecção de Defeitos Funcionais do Espermatozoide Humano

Apresentamos aqui um método para fenótipo mecânico de células individuais usando uma plataforma microfluídica baseada em eletrônica chamada detecção de mechano-node-pore (mechano-NPS). Esta plataforma mantém um rendimento moderado de 1-10 células/s enquanto mede as propriedades biofísicas elásticas e viscosas das células.

Mechano-Node-Pore Sensing: Uma plataforma rápida e sem rótulos para medições viscoelásticas de célula única multiparâmetro

Aprenda a medir forças de tração celular por citometria de fluxo de alto rendimento usando sondas de DNA imobilizadas. Este método avança a compreensão da mecanobiologia e auxilia no desenvolvimento de mecanoterapêuticos.

Medição de citometria de fluxo de alto rendimento do mecanótipo celular com base na ruptura e entrega de sondas de tensão de DNA nas células (Vídeo) | JoVE Journal

Medição de citometria de fluxo de alto rendimento do mecanótipo celular com base na ruptura e entrega de sondas de tensão de DNA nas células

Explorar mais vídeos