Medição de citometria de fluxo de alto rendimento do mecanótipo celular com base na ruptura e entrega de sondas de tensão de DNA nas células

Nosso laboratório geralmente estuda os mecanismos moleculares que as células usam para transmitir estímulos mecânicos. Recentemente, temos desenvolvido métodos de alto rendimento para medir as forças que as células exercem em seus arredores para trazer a mecanobiologia para a era ômica. Os estudos implicam forças mecânicas em como as células T são ativadas pelo antígeno correto e como as células-tronco se diferenciam em tipos de células especializadas.

Recentemente, o direcionamento de processos subjacentes à mecânica celular desregulada levou ao desenvolvimento de mecanoterapias como um caminho para tratar doenças. Os sensores duplex e hairpin de DNA medem forças extracelulares, enquanto os sensores geneticamente codificados permitem medições intracelulares. Quase todos requerem microscópios de última geração.

A microscopia de força de tração pode medir a força que as células exercem em seus arredores, mas também envolve imagens de alta resolução. Abordamos três desafios no campo neste trabalho, um, usando citometria de fluxo para medição de força em vez de imagem, dois, empregando a tecnologia de tag HOH para anexar ligantes e anticorpos a sondas de DNA e três, utilizando placas de cultura de células padrão sem tratamentos especiais de superfície. Como as mudanças nas forças geradas pelas células podem ser usadas como um marcador prognóstico para o estado de doença, e essas forças estão contribuindo ou são um efeito secundário desse estado de doença?

Para começar, monte os duplex em uma proporção de 1,1 para um molar de cordão âncora com atenuante para fio ligante com fluoróforo. Preparar os duplex numa concentração final de 40 fitas ligantes micromolares na solução. Para recozer os duplex montados, incube-os a 98 graus Celsius por cinco minutos.

Em seguida, deixe a mistura esfriar em temperatura ambiente por uma hora longe da luz. Reaja os duplex recozidos com HUH usando a concentração da fita menos abundante da etapa de recozimento, que neste caso, é a fita ligante. Misture os duplex com HUH em uma proporção de um para dois molares a uma concentração final de 10 micromolares duplex e 20 micromolares HUH.

Incube a reação a 37 graus Celsius por 30 minutos em um termociclador ou em um bloco de calor protegido contra luz. Após a incubação, remova a reação do calor e use uma minicentrífuga de bancada para girar as amarras do medidor de tensão agora montadas, ou TGTs. Quando os TGTs aderirem adequadamente, lave os poços com as células desejadas três vezes com PBS.

Em seguida, faça duas lavagens com meio sem soro e deixe o meio nos poços após a lavagem final. Adicione 200 microlitros de PBS aos poços periféricos para mitigar os efeitos de borda. Transfira a placa para uma incubadora de 37 graus Celsius para pré-aquecer a placa.

Em seguida, recupere as células de interesse em aproximadamente 80% de confluência. Aspire o meio, depois lave as células com PBS e incube as células com tripsina a 37 graus Celsius até que as células se dissociem, o que leva aproximadamente cinco a 10 minutos. Uma vez dissociadas as células, adicione o volume original do meio celular completo usado para manter as células.

Ressuspender as células com uma pipeta serológica e transferir a suspensão celular para um tubo cónico de 15 ml. Centrifugar as células a 300 G durante quatro minutos. Aspirar o meio e ressuspender o chumbinho em PBS.

Depois de repetir a centrifugação, ressuspender as células em cinco mililitros de meio sem soro e centrifugar novamente. Aspire e ressuspenda as células em aproximadamente dois mililitros de meio sem soro. Determine a densidade das células ressuspensas para ajustar a concentração conforme desejado.

Opcionalmente, se estiver testando os efeitos do medicamento, adicione a concentração apropriada do medicamento às células e devolva as células à incubadora para o tempo de pré-incubação antes de prosseguir. Agora, recupere a placa original da incubadora e remova o meio residual deixado da lavagem nos poços experimentais. Lave os poços uma vez com o meio desejado e pipete 100 microlitros das células ressuspensas nos poços desejados.

Transfira as células plaqueadas para a incubadora por 90 minutos. Após a incubação, remova aproximadamente 125 a 170 microlitros de volume de cada poço. Se necessário, lave as células suavemente com 200 microlitros de PBS aquecido.

Em seguida, incube as células em cada poço com 50 microlitros de tripsina até que as células comecem a se dissociar, o que leva aproximadamente cinco a 10 minutos. Em seguida, adicione 160 microlitros de buffer de fluxo recém-preparado a cada poço. Pipete suavemente para cima e para baixo para dissociar as células.

Transfira 196 microlitros desta suspensão celular para tubos de PCR, adicione quatro microlitros de iodeto de propídio e misture suavemente. Por fim, coloque os tubos em um balde de gelo com tampa bloqueando qualquer luz e meça a intensidade da fluorescência usando um citômetro de fluxo. O gating por citometria de fluxo confirmou o isolamento bem-sucedido de células vivas únicas, garantindo uma análise precisa do mecanótipo.

Um controle negativo, definido no percentil 99 da fluorescência Cy5-A, forneceu uma linha de base para a comparação das condições experimentais. As células CHO-K1 tratadas com Y27632 mostraram uma diminuição significativa na porcentagem de células que excederam a porta de controle negativo em TGTs de cisalhamento, enquanto os TGTs descompactados exibiram apenas uma diminuição modesta e estatisticamente insignificante. A descompactação de TGTs resultou consistentemente em uma porcentagem maior de células excedendo o controle negativo em comparação com TGTs de cisalhamento, confirmando sua menor necessidade de força.