Name: Geração de culturas primárias para imagens de células vivas de queratinócitos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T13:25:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Aprenda a gerar culturas primárias de queratinócitos para imagens de células vivas. Este protocolo utiliza células de passagem zero para observar processos celulares em tempo real.

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<ol><li>Mateu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+differences+between+neonatal+and+adult+fibroblasts+and+keratinocytes%3A+Donor+age+affects+epithelial-mesenchymal+crosstalk+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Functional differences between neonatal and adult fibroblasts and keratinocytes: Donor age affects epithelial-mesenchymal crosstalk in vitro.</a> Int J Mol Med. 38 (4), 1063-1074 (2016).</li>
<li>Handl, J., Čapek, J., Majtnerová, P., Báčová, J., Roušar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+repeated+passaging+on+the+susceptibility+of+human+proximal+tubular+HK-2+cells+to+toxic+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Phy+Res+Aca+Sci+Boh%22%5BJournal%5D)">The effect of repeated passaging on the susceptibility of human proximal tubular HK-2 cells to toxic compounds.</a> Phy Res Aca Sci Boh. 69 (4), 731-738 (2020).</li>
<li>Xiao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+cell+cycle+duration+is+a+phenotype+of+human+epidermal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+The%22%5BJournal%5D)">Short cell cycle duration is a phenotype of human epidermal stem cells.</a> Stem Cell Res The. 15 (1), 76(2024).</li>
<li>Noujarède, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingolipid+paracrine+signaling+impairs+keratinocyte+adhesion+to+promote+melanoma+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Sphingolipid paracrine signaling impairs keratinocyte adhesion to promote melanoma invasion.</a> Cell Rep. 42 (12), 113586(2023).</li>
<li>Sun, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+image-based+dynamic+high-throughput+analysis+of+adherent+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-prol%22%5BJournal%5D)">An image-based dynamic high-throughput analysis of adherent cell migration.</a> Bio-prol. 11 (6), e3957(2021).</li>
<li>Chapman, S., McDermott, D. H., Shen, K., Jang, M. K., McBride, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+Rho+kinase+inhibition+on+long-term+keratinocyte+proliferation+is+rapid+and+conditional%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+The%22%5BJournal%5D)">The effect of Rho kinase inhibition on long-term keratinocyte proliferation is rapid and conditional.</a> Stem Cell Res The. 5 (2), 60(2014).</li>
<li>U.S. Department of Health and Human Services. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Biosafety+in+microbiological+and+biomedical+laboratories%22">Biosafety in microbiological and biomedical laboratories</a>. , 6th edition, Centers for Disease Control and Prevention, National Institutes of Health. USA. (2020).</li>
<li>Poumay, Y., Roland, I. H., Leclercq-Smekens, M., Leloup, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+detachment+of+the+epidermis+using+dispase%3A+tissue+spatial+organization+and+fate+of+integrin+alpha+6+beta+4+and+hemidesmosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Inv+Der%22%5BJournal%5D)">Basal detachment of the epidermis using dispase: tissue spatial organization and fate of integrin alpha 6 beta 4 and hemidesmosomes.</a> J Inv Der. 102 (1), 111-117 (1994).</li>
<li>Tsuji, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+different+cell-detaching+methods+on+the+viability+and+cell+surface+antigen+expression+of+synovial+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22CellTra%22%5BJournal%5D)">Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells.</a> CellTra. 26 (6), 1089-1102 (2017).</li>
<li>Rheinwald, J. G., Green, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+cultivation+of+strains+of+human+epidermal+keratinocytes%3A+the+formation+of+keratinizing+colonies+from+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells.</a> Cell. 6 (3), 331-343 (1975).</li>
<li>Boisseau, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+epidermal+sheets+in+a+serum+free+culture+system%3A+a+further+appraisal+of+the+role+of+extracellular+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Der+Sci%22%5BJournal%5D)">Production of epidermal sheets in a serum free culture system: a further appraisal of the role of extracellular calcium.</a> J Der Sci. 3 (2), 111-120 (1992).</li>
<li>Roshan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+keratinocytes+have+two+interconvertible+modes+of+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">Human keratinocytes have two interconvertible modes of proliferation.</a> Nat Cell Bio. 18 (2), 145-156 (2016).</li>
<li>Nanba, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGFR-mediated+epidermal+stem+cell+motility+drives+skin+regeneration+through+COL17A1+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">EGFR-mediated epidermal stem cell motility drives skin regeneration through COL17A1 proteolysis.</a> J Cell Bio. 220 (11), e202012073(2021).</li>
<li>Ścieżyńska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+human+primary+keratinocytes-a+methods+review%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Der%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of human primary keratinocytes-a methods review.</a> Exp Der. 28 (2), 107-112 (2019).</li>
<li>Guo, A., Jahoda, C. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+of+human+keratinocyte+culture+from+skin+explants%3A+cell+expansion+is+linked+to+markers+of+activated+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Derm%22%5BJournal%5D)">An improved method of human keratinocyte culture from skin explants: cell expansion is linked to markers of activated progenitor cells.</a> Exp Derm. 18 (8), 720-726 (2009).</li>
<li>Orazizadeh, M., Hashemitabar, M., Bahramzadeh, S., Dehbashi, F. N., Saremy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+enzymatic+and+explant+methods+for+the+culture+of+keratinocytes+isolated+from+human+foreskin%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Rep%22%5BJournal%5D)">Comparison of the enzymatic and explant methods for the culture of keratinocytes isolated from human foreskin.</a> Bio Rep. 3 (3), 304-308 (2015).</li>
<li>Usta, S. N., Scharer, C. D., Xu, J., Frey, T. K., Nash, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+serum-free+and+xeno-free+media+for+multiple+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+of+tra+med%22%5BJournal%5D)">Chemically defined serum-free and xeno-free media for multiple cell lineages.</a> Ann of tra med. 2 (10), 97(2014).</li>
<li>Lenihan, C., Rogers, C., Metcalfe, A. D., Martin, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+isolation+and+culture+methods+on+epithelial+stem+cell+populations+and+their+progeny-toward+an+improved+cell+expansion+protocol+for+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Cyt%22%5BJournal%5D)">The effect of isolation and culture methods on epithelial stem cell populations and their progeny-toward an improved cell expansion protocol for clinical application.</a> Cyt. 16 (12), 1750-1759 (2014).</li>
<li>Bernstam, L. I., Vaughan, F. L., Bernstein, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocytes+grown+at+the+air-liquid+interface%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Keratinocytes grown at the air-liquid interface.</a> In Vitro Cell Dev Biol. 22 (12), 695-705 (1986).</li>
<li>Ponce, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+cultivation+of+primary+keratinocytes+from+piglet+skin+for+compartmentalized+co-culture+with+dorsal+root+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">Isolation and cultivation of primary keratinocytes from piglet skin for compartmentalized co-culture with dorsal root ganglion neurons.</a> J Cell Bio. 2 (2), 93-115 (2017).</li>
<li>Nygaard, U. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotics+in+cell+culture%3A+friend+or+foe%3F+Suppression+of+keratinocyte+growth+and+differentiation+in+monolayer+cultures+and+3D+skin+models%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Der%22%5BJournal%5D)">Antibiotics in cell culture: friend or foe? Suppression of keratinocyte growth and differentiation in monolayer cultures and 3D skin models.</a> Exp Der. 24 (12), 964-965 (2015).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0,05% Tripsina-EDTA (1X), 100 mL</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de célula 100 um</td><td>Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 cc</td><td>Corning</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Falcon cônico de 50 cc</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Microplaca de 6 poços</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>70% de álcool reagente, 4 L</td><td>VWR Chemicals</td><td>BDH1164-4LP</td><td>Alternativamente, pode diluir o seu próprio</td></tr><tr><td>Anfotericina B, 50 ml</td><td>Corning</td><td>30-003-CF</td><td>Diluir para 5X (50 ug/mL)</td></tr><tr><td>Dipase, 100 ml</td><td>Corning</td><td>354235</td><td>Dilua 1:1 com HBSS, adicione 1x gentamicina, esterilize com filtro</td></tr><tr><td>Epilife, 50 mL</td><td>Gibco</td><td>MEP1500CA</td><td>Adicione HKGS, considere antibióticos</td></tr><tr><td>Valor do Soro Bovino Fetal FBS Inativado por Calor, 500 ml</td><td>Gibco</td><td>A52568-01</td><td>FBS</td></tr><tr><td>Fórceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina, 10 ml</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td>Dilua para 50 ug/ml por 5X</td></tr><tr><td>Solução Salina Balanceada do Hank (1X), 500 ml</td><td>Gibco</td><td>14170-112</td><td>(HBSS)</td></tr><tr><td>HBSS 5X PSAG</td><td></td><td></td><td>Isso é HBSS + 5X as concentrações de Pen/Strep/Ampho/Gent</td></tr><tr><td>Hibiclens, galão</td><td>Molnlycke</td><td>57591</td><td>Dilua a 10% usando H2O desionizado</td></tr><tr><td>Soro de Crescimento de Ceratinócitos Humanos, 5 mL</td><td>Gibco</td><td>S-001-5</td><td>Adicionado à epivida</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina, 100 ml</td><td>Corning</td><td>30-002-CL</td><td>Diluir para 5X (vem na versão 100x original) para 5X PSA - 1X para mudanças de mídia</td></tr><tr><td>Placa de Petri 100 mm x 15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de Bisturi Nº 23</td><td>VWR</td><td>76457-480</td><td></td></tr><tr><td>Triple</td><td>Gibco</td><td>12604021</td><td>Uma alternativa menos cáustica à tripsina comum</td></tr><tr><td>Solução Neutralizadora de Tripsina</td><td></td><td></td><td>(TNS), isso é HBSS com 10% de FBS (alguns usam menos soro, 5%)</td></tr></tbody></table>

geração de culturas primárias para imagens de células vivas de queratinócitos

Generating Primary Cultures for Keratinocyte Live Cell Imaging

Geração de culturas primárias para imagens de células vivas de queratinócitos

Tracking stem cells and committed progenitor behavior at the single-cell level in human skin has been challenging both in vivo and in ...

generating-primary-cultures-for-keratinocyte-live-cell-imaging

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Geração de Culturas Raft organotípicas de queratinócitos humanos primários

Este vídeo descreve o isolamento de queratinócitos - as células mais proeminentes da camada epidérmica da pele humana, empregando uma combinação de digestão enzimática e métodos de ruptura mecânica. Este método ajuda no crescimento preferencial de queratinócitos em relação a outros tipos de células da pele usando um meio de crescimento seletivo.

Isolamento de queratinócitos da pele humana: um método para cultivar queratinócitos primários de amostras de pele

Neste vídeo, realizamos um ensaio clonogênico de queratinócitos colhidos de camundongos adultos para determinar a capacidade de células individuais de proliferar e formar colônias. Esta técnica de colheita de queratinócitos é útil para estudar outros aspectos a jusante da carcinogênese química cutânea e promoção do tumor.

Ensaio de formação de colônias de queratinócitos: um ensaio in vitro para avaliar a capacidade dos queratinócitos de se transformarem em colônias

Este manuscrito fornece um procedimento passo a passo para a derivação e manutenção de queratinócitos humanos a partir de cabelos arrancados e subsequente geração de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos livres de integração (hiPSCs) por vetores epissómicos.

Geração de Integração Induced-livre Human células estaminais pluripotentes usando o cabelo derivado queratinócitos

O objetivo deste artigo é fornecer um protocolo abrangente e detalhado sobre como gerar pele organotípica humana geneticamente modificada a partir de queratinócitos epidérmicos e derme humana desvitalizada.

Geração de Culturas Geneticamente Modificados Pele organotï¿½icas Usando desvitalizado derme humana

Os queratinócitos epidérmicos formam uma barreira funcional da pele e são posicionados na linha de frente da defesa do hospedeiro contra insultos ambientais externos. Aqui descrevemos métodos para isolamento e cultura primária de queratinócitos epidérmicos de pele de rato neonatal e adulta e indução de diferenciação terminal e resposta inflamatória desencadeada por UVB de queratinócitos.

Isolamento e Cultura de Queratinócitos de Rato Primário de Pele de Rato Neonatal e Adulto

A pele humana age como uma primeira linha de defesa contra o ambiente externo. Apresentamos um método para isolar os queratinócitos humanos primários da pele adulta. Estes queratinócitos isolados são úteis em inúmeras configurações experimentais e são um modelo altamente adequado para estudar os mecanismos moleculares em biologia cutânea em vitro.

Geração e cultivo de queratinócitos humanos primários da pele de adulto

Aqui nós apresentamos um protocolo para isolar eficientemente queratinócitos humanos primários de tecidos de pele de adultos. Este método simplifica o procedimento convencional usando o Y-27632 de inibidor ROCK no meio de inoculação espontaneamente separar células epidérmicas de células dérmicas.

Um método simplificado e eficiente para isolar os queratinócitos humanos primários do tecido da pele de adultos

O objetivo deste protocolo é isolar os queratinócitos epidérmicos da pele dorsal de camundongos adultos para uma variedade de aplicações a jusante, como biologia molecular, bioquímica, triagem de células ativadas por fluorescência e usos primários in vitro (por exemplo, clonogênicos queratinócitos).

Isolamento dos keratinócitos epidérmicos do camundongo e sua cultura Clonogênica in vitro

Aqui descrevemos um protocolo para o cultivo sistemático de esferoides epidérmicos na cultura de suspensão 3D. Este protocolo possui amplas aplicações para uso em uma variedade de tipos de tecido epitelial e para a modelagem de várias doenças e condições humanas.

Estabelecendo um sistema de cultura esferoide epidérmico de alta produtividade para modelar a plasticidade das células-tronco de ceratinócito

Aqui, fornecemos um método para análise de imagem de células vivas que pode ser usado para rastrear manualmente as linhagens de queratinócitos de passagem 0 e que permite a coleta de métricas de proliferação, incluindo o destino da divisão celular e a duração do ciclo celular.

Imagens de células vivas com fotografia de lapso de tempo para estudar a cinética de proliferação de queratinócitos epidérmicos

Aprenda a gerar culturas primárias de queratinócitos para imagens de células vivas. Este protocolo utiliza células de passagem zero para observar processos celulares em tempo real.

Geração de culturas primárias para imagens de células vivas de queratinócitos

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