Isolamento e Identificação de Cepas Bacterianas da Pele de Anfíbios Terrestres

Esta pesquisa teve como objetivo desenvolver um protocolo eficiente para coleta de microbiota cutânea de anfíbios terrestres silvestres e garantir a integridade microbiana durante o armazenamento e manuseio.

Os principais desafios incluem prevenir a contaminação da amostra, manter a viabilidade microbiana durante o armazenamento e cultivar o crescimento lento para avaliar completamente a diversidade da microbiota da pele dos anfíbios.

Foi estabelecido que a solução salina aprimorada com glicerol preserva a integridade da microbiota da pele dos anfíbios durante o armazenamento e manuseio, cultura bacteriana consistente e melhoria das estratégias de conservação microbiana para pesquisa ecológica e biotecnológica.

Este protocolo aborda a falta de métodos de amostragem padronizados, preserva e manipula bactérias cultiváveis da pele de anfíbios e garante a integridade da comunidade.

[Narrador] Para começar, esterilize o meio em autoclave a 121 a 134 graus Celsius por 15 a 30 minutos. Após a autoclavagem, deixe o meio de ágar esfriar até aproximadamente 45 a 50 graus Celsius. Sob uma capela de fluxo laminar previamente esterilizada, despeje o meio resfriado em placas de Petri estéreis. Assim que o ágar solidificar, rotule as placas de Petri com o tipo médio e a data de preparação. Misture a amostra obtida no campo com a solução empurrando o cotonete contra as paredes do tubo enquanto aperta o tubo e gira o cotonete completamente, 10 vezes no sentido horário e 10 vezes no sentido anti-horário. Misture bem a amostra microbiológica antes de processar. Preparar a diluição seriada da amostra cutânea com solução salina variando de 10 elevado a -1 a 10 elevado a -6. Inocular 100 microlitros da amostra não diluída e diluição em série nas placas de ágar preparadas. Usando uma alça estéril em forma de L, risque a amostra pela superfície do meio de ágar, garantindo uma distribuição uniforme sem aplicar pressão excessiva. Inverta as placas inoculadas e coloque-as dentro de uma incubadora ajustada a 20 a 25 graus Celsius por três a cinco dias para apoiar o crescimento de bactérias mesófilas e psicotrópicas na pele dos anfíbios. Após a incubação, selecione colônias bacterianas com morfologias distintas para análise posterior. Certifique-se de que as colônias estejam bem isoladas e exibam aparências diferentes, como variações de cor, tamanho, forma, borda, superfície ou textura. Para subcultivar as colônias selecionadas, transfira uma colônia bem isolada da placa de ágar original para uma placa de ágar fresca usando uma alça de inoculação em condições assépticas. Risque a colônia para isolá-la. E então incube-o adequadamente. O procedimento de amostragem coordenada de um indivíduo speleomantes italicus usando ferramentas estéreis em um ambiente de campo é mostrado aqui. A amostragem foi realizada por dois operadores usando luvas e swabs estéreis para minimizar o estresse no anfíbio e garantir a precisão durante o manuseio. O swab foi imediatamente transferido para uma solução salina com glicerol a 20% para preservar a integridade microbiana durante o transporte para o laboratório. Uma comparação da densidade da comunidade microbiana mantida em solução salina com e sem adição de glicerol é mostrada aqui. A carga bacteriana no armazenamento de solução salina sem glicerol foi significativamente menor do que o controle e solução salina com glicerol. A comunidade microbiana armazenada em solução salina com glicerol apresentou carga bacteriana semelhante à controle, indicando a preservação da integridade microbiana. A melhor preservação da comunidade microbiana foi observada em solução salina com glicerol armazenado a quatro graus Celsius, apresentando a carga bacteriana mais estável ao longo do tempo. O armazenamento em solução salina isolada à temperatura ambiente resultou no maior crescimento bacteriano, indicando contaminação microbiana ou promoção seletiva de certos grupos bacterianos. O congelamento a menos 20 graus Celsius reduziu a carga bacteriana, sugerindo que as baixas temperaturas impactaram negativamente a sobrevivência microbiana.