Name: Uso de montagem in vivo para construção de plasmídeo de alta eficiência (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
Description: Aprenda a montagem in vivo para clonagem de DNA com alta eficiência em E. coli. Este método elimina enzimas especializadas, reduzindo custos e tempo na pesquisa genética.

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<ol><li>Bertero, A., Brown, S., Vallier, L. Methods of cloning. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBertero%2C+A+%22Basic+Science+Methods+for+Clinical+Researchers%22">Basic Science Methods for Clinical Researchers</a>. Chapter 2, Academic Press. 19-39 (2017).</li>
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<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).</li>
<li>Engler, C., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Golden+Gate+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Golden Gate cloning.</a> Methods Mol Biol. 1116, 119-131 (2014).</li>
<li>Ma, H., Kunes, S., Schatz, P. J., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmid+construction+by+homologous+recombination+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Plasmid construction by homologous recombination in yeast.</a> Gene. 58 (2-3), 201-216 (1987).</li>
<li>Cao, P., Wang, L., Zhou, G., Wang, Y., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+assembly+of+multiple+DNA+fragments+through+direct+transformation+of+PCR+products+into+E.+coli+and+Lactobacillus%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">Rapid assembly of multiple DNA fragments through direct transformation of PCR products into E. coli and Lactobacillus.</a> Plasmid. 76, 40-46 (2014).</li>
<li>Conley, E. C., Saunders, V. A., Saunders, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+and+rearrangement+of+plasmid+DNA+during+transformation+of+Escherichia+coli+with+linear+plasmid+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Deletion and rearrangement of plasmid DNA during transformation of Escherichia coli with linear plasmid molecules.</a> Nucleic Acids Res. 14 (22), 8905-8917 (1986).</li>
<li>Conley, E. C., Saunders, V. A., Jackson, V., Saunders, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+intramolecular+recyclization+and+deletion+formation+following+transformation+of+Escherichia+coli+with+linearized+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanism of intramolecular recyclization and deletion formation following transformation of Escherichia coli with linearized plasmid DNA.</a> Nucleic Acids Res. 14 (22), 8919-8932 (1986).</li>
<li>Sung, W. L., Zahab, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+recombination+directed+by+single-stranded+crossover+linkers%3A+specific+deletion+of+the+amino-terminal+region+of+the+beta-galactosidase+gene+in+pUC+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22DNA%22%5BJournal%5D)">Site-specific recombination directed by single-stranded crossover linkers: specific deletion of the amino-terminal region of the beta-galactosidase gene in pUC plasmids.</a> DNA. 6 (4), 373-379 (1987).</li>
<li>Mandecki, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligonucleotide-directed+double-strand+break+repair+in+plasmids+of+Escherichia+coli%3A+a+method+for+site-specific+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 83 (19), 7177-7181 (1986).</li>
<li>Jones, D. H., Howard, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+recombination+and+site-specific+mutagenesis+by+placing+homologous+ends+on+DNA+using+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A rapid method for recombination and site-specific mutagenesis by placing homologous ends on DNA using polymerase chain reaction.</a> Biotechniques. 10 (1), 62-66 (1991).</li>
<li>Kostylev, M., Otwell, A. E., Richardson, R. E., Suzuki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+should+be+simple%3A+Escherichia+coli+DH5alpha-mediated+assembly+of+multiple+DNA+fragments+with+short+end+homologies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cloning should be simple: Escherichia coli DH5alpha-mediated assembly of multiple DNA fragments with short end homologies.</a> PLoS One. 10 (9), e0137466(2015).</li>
<li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+plasmid+cloning+with+a+universal+MCS+design+and+bacterial+in+vivo+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Simplified plasmid cloning with a universal MCS design and bacterial in vivo assembly.</a> BMC Biotechnol. 21 (1), 24(2021).</li>
<li>Braun, H. G., Kanwal, N., Rivera Lopez, L. F., Thomassin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+plasmid+series+for+rapid+sub-cloning+and+use+in+various+Enterobacteriaceae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Generation of a plasmid series for rapid sub-cloning and use in various Enterobacteriaceae.</a> J Biosci Bioeng. 138 (6), 478-487 (2024).</li>
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<li>Wallace, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybridization+of+synthetic+oligodeoxyribonucleotides+to+phi+chi+174+DNA%3A+the+effect+of+single+base+pair+mismatch%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Hybridization of synthetic oligodeoxyribonucleotides to phi chi 174 DNA: the effect of single base pair mismatch.</a> Nucleic Acids Res. 6 (11), 3543-3557 (1979).</li>
<li>Bzymek, M., Lovett, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instability+of+repetitive+DNA+sequences%3A+The+role+of+replication+in+multiple+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Instability of repetitive DNA sequences: The role of replication in multiple mechanisms.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98 (15), 8319-8325 (2001).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), e3923(2012).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inoue+method+for+preparation+and+transformation+of+competent+E.+coli%3A+%26%2334%3Bultra-competent%26%2334%3B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">The inoue method for preparation and transformation of competent E. coli: &#34;ultra-competent&#34; cells.</a> CSH Protoc. 2006 (1), (2006).</li>
<li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> J Vis Exp. (6), e253(2007).</li>
<li>Fürste, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+of+the+plasmid+RP4+primase+region+in+a+multi-host-range+tacP+expression+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning of the plasmid RP4 primase region in a multi-host-range tacP expression vector.</a> Gene. 48 (1), 119-131 (1986).</li>
<li>Bäumler, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+new+iron+regulated+locus+of+Salmonella+typhi%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Identification of a new iron regulated locus of Salmonella typhi.</a> Gene. 183 (1-2), 207-213 (1996).</li>
<li>Godiska, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+plasmid+vector+for+cloning+of+repetitive+or+unstable+sequences+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Linear plasmid vector for cloning of repetitive or unstable sequences in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Res. 38 (6), e88(2010).</li>
<li>Watson, J. F., Garcia-Nafria, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+DNA+assembly+using+common+laboratory+bacteria%3A+A+re-emerging+tool+to+simplify+molecular+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">In vivo DNA assembly using common laboratory bacteria: A re-emerging tool to simplify molecular cloning.</a> J Biol Chem. 294 (42), 15271-15281 (2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1 kb Plus escada de DNA</td><td>FroggaBio</td><td>DM015-R500 Marcador de</td><td>peso molecular de DNA</td></tr><tr><td>AccuReady M Canal Único 0.5-10 &micro; L</td><td>Bulldog Bio</td><td>BPP020</td><td>Pipetas para transferência de líquido</td></tr><tr><td>Kit de pipetador de canal único AccuReady M</td><td>Bulldog Bio</td><td>BPK100</td><td>Pipetas para transferência de</td></tr><tr><td>líquido Agar</td><td>BioShop Canada</td><td>AGR003.1</td><td>Agente solidificante para meio de crescimento</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Biobasic</td><td>D0012</td><td>Faça géis de agarose para eletroforese de DNA</td></tr><tr><td>Biometra TOne&nbsp;</td><td>Analytikjena</td><td>846-2-070-301</td><td>Thermocycler</td></tr><tr><td>Caps para tubos de cultura de vidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-957-91</td><td>Caps reutilizáveis para tubos de cultura de vidro</td></tr><tr><td>Primers de DNA Tecnologias</td><td>de DNA integradas</td><td>N/A</td><td>Ligar e amplificar DNA modelo em reação de PCR</td></tr><tr><td>DpnI&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176S</td><td>Clivagem DNA molde metilado após amplificação por PCR</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R3101L</td><td>Enzima de restrição, vem com tampão apropriado</td></tr><tr><td>Microtubos Eppendorf 1,5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.300</td><td>Microtubo, 1,5 mL, base cônica, PP, tampa plana anexada, graduações moldadas e espaço de escrita fosco</td></tr><tr><td>Brometo de etídio</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAL0748203</td><td>Agente de visualização/intercalação de DNA, tóxico</td></tr><tr><td>Kit Miniprep de DNA de plasmídeo de coluna giratória EZ-10</td><td>Biobasic</td><td>BS614</td><td>Isole o DNA do plasmídeo de culturas bacterianas durante a noite</td></tr><tr><td>Sistema GelDoc Go-Gel</td> de DNA de imagem <td>Bio-Rad</td><td>12009077</td><td>Tubos</td>de</tr><tr><td>cultura de vidro Fisher</td><td>Scientific</td><td>14-925E</td><td>Tubos de cultura de vidro</td></tr><tr><td>myGel&nbsp; Sistema de Mini Eletroforese</td> Sistema <td>de Z742288</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>usado para eletroforese em gel</td></tr><tr><td>NanoDrop One</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-ONE-W</td><td>Determine a concentração</td></tr><tr><td>de DNA PCR Limpe para sequenciamento de DNA</td><td>Biobasic</td><td>BT5100</td><td>Purify produtos de PCR&nbsp;</td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Sarstedt</td><td>82.1473.011</td><td>Placa de Petri 92 x 16 mm, PS, transparente, com cames de ventilação</td></tr><tr><td>Ponta de pipeta, 1000 &micro; L</td><td>Sarstedt</td><td>70.305</td><td>Ponteiras de pipeta para 100-1000 &micro; L</td></tr><tr><td>Ponta de pipeta, 2,5 &micro; L</td><td>Sarstedt</td><td>70.3010.265</td><td>Ponteiras de pipeta para até 2,5 &micro; L</td></tr><tr><td>Ponta de pipeta, 20 &micro; L</td><td>Sarstedt</td><td>70.3020.200</td><td>Ponteiras de pipeta para até 20 &micro; L</td></tr><tr><td>Ponta de pipeta, 200 &micro; L</td><td>Sarstedt</td><td>70.3030.020</td><td>Ponteiras de pipeta para 1-200 &micro; L</td></tr><tr><td>Sal (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-10</td><td>Componente do meio de crescimento bacteriano (10 g/L)</td></tr><tr><td>Tubos de PCR simples de 0,2 mL com tampa plana</td><td>Tubos de PCR FroggaBio</td><td>TF-1000</td><td></td></tr><tr><td>Triptona (Bacteriológica)</td><td>BioShop Canada</td><td>TRP402.5</td><td>Componente do meio de crescimento bacteriano (10 g/L)</td></tr><tr><td>VeriFi DNA polimerase</td><td>PCR Biosystems</td><td>PB10.42-01</td><td>A polimerase de alta fidelidade, o tampão PCR contendo Mg2+ e dNTPs é fornecido com purchase</td></tr><tr><td>Xba I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0145S</td><td>Enzima de restrição, vem com tampão apropriado</td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>BioShop Canada</td><td>YEX401.205</td><td>Componente do meio de crescimento bacteriano (5 g/L)</td></tr></tbody></table>

uso de montagem in vivo para construção de plasmídeo de alta eficiência

Use of In Vivo Assembly for High-efficiency Plasmid Construction

Neste manuscrito, como exemplo de uso do IVA, seguimos o fluxo de trabalho do IVA fornecido para reclonar o quadro de leitura aberto mCherry no local de clonagem múltipla do plasmídeo pSU19 para gerar um plasmídeo idêntico ao pSU19mCherry (Figura 3)17. Os primers adequados para IVA foram projetados com base nas etapas 1.1 e 1.2 do protocolo. Em seguida, um kit de isolamento de plasmídeo foi usado para isolar pSU19 e pSU18mCherry, que serviram como modelos para reações...

Uso de montagem in vivo para construção de plasmídeo de alta eficiência

In vivo assembly (IVA) is a molecular cloning method that uses intrinsic enzymes present in bacteria that promote intermolecular recombination of DNA ...

use-of-in-vivo-assembly-for-high-efficiency-plasmid-construction

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Um método rápido e eficiente para integrar DNA estranho de juros em cepas pré-fabricados receptoras, chamadas de tensões almofada de aterragem, é descrito. O método permite site-specific integração de uma cassete de ADN no locus engenharia aterragem almofada de uma estirpe dada, por meio de conjugação e expressão da integrase ΦC31.

Site-specific Engenharia cromossomo bacteriano: ΦC31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

Fonte: Tomás, J. M., et al. Geração de mutantes nulos para elucidar o papel das glicosiltransferases bacterianas na motilidade bacteriana. J. Vis. Exp. (2022).Este vídeo demonstra a amplificação dependente do iniciador de um plasmídeo suicida em E. coli. O plasmídeo, que carrega um gene de resistência a antibióticos, se replica apenas na presença de uma proteína iniciadora codificada pelo hospedeiro. Após eletroporação e incubação em meio de recuperação, a mistura é semeada em ágar contendo...

Amplificação de um plasmídeo suicida em um hospedeiro bacteriano

Metodologias de direcionamento de genes podem ser usadas para gerar camundongos transgênicos com alelos knockout, knock-in e marcados.  Aqui, descrevemos um método aprimorado de recombinação em E. coli, que chamamos de 'subclonagem mais inserção', que pode ser usado para gerar vetores de direcionamento de genes personalizados rapidamente.

Subclonagem Além disso Inserção (SPI) - Um Método recombineering Novel para a construção rápida de Gene Segmentação Vetores

A síntese de plasmídeos personalizados é trabalhosa e demorada. Este protocolo descreve o uso da clonagem de montagem Gibson para reduzir o trabalho e a duração do procedimento de clonagem de DNA personalizado. O protocolo descrito também produz construções de proteínas marcadas confiáveis para a expressão de mamíferos a um custo semelhante à clonagem tradicional de DNA de cortar e colar.

Geração de plasmídeo vectores que expressam proteínas marcadas-bandeira nos termos do regulamento de Alongamento Human Fator-1α Promotor Usando Assembleia Gibson

Domínios dedo-de-zinco são intrinsecamente célula-permeável e capaz de mediar a entrega de proteína em uma ampla gama de tipos de células de mamíferos. Aqui, um protocolo detalhado passo-a-passo para a implementação da tecnologia de dedo de zinco para a entrega intracelular de proteínas é apresentada.

Entrega Protein direto para células de mamíferos utilizando células-permeável Cys<sub&gt; 2</sub&gt; -His<sub&gt; 2</sub&gt; Domínios zinc-finger

Aqui, apresentamos a montagem de quimera por recuperação de plasmídeo e inserção de site de enzima de restrição (CAPRRESI), um protocolo baseado na inserção de sites de enzimas de restrição em seqüências de DNA sinônimo e recuperação de plasmídeo funcional. Este protocolo é um método rápido e de baixo custo para a fusão de genes que codificam proteínas.

CAPRRESI: montagem de quimera por recuperação de plasmídeos e restrição de inserção do site enzimático

Aqui, apresentamos um protocolo para produzir grandes quantidades de RNA recombinante em Escherichia coli expressando co um RNA quimérico que contém o RNA de interesse em um andaime viroid e uma planta ligase do tRNA. O principal produto é uma molécula circular que facilita a purificação de homogeneidade.

Produção em grande escala de RNAs recombinantes em um andaime Circular usando um sistema derivado de Viroid em Escherichia coli

O objetivo deste protocolo é fornecer um guia detalhado passo a passo para a montagem de construções multigênicas usando o sistema de clonagem modular baseado na clonagem golden gate. Ele também dá recomendações sobre etapas críticas para garantir a montagem ideal com base em nossas experiências.

Montagem rápida de construções multigênicas usando clonagem modular de golden gate

Este artigo apresenta um protocolo passo a passo demonstrando como a Clonagem Modular (MoClo) pode ser adaptada para a clonagem de operons policistrônicos.

Montagem modular padronizada de operons policistrônicos com clonagem modular (MoClo) usando o kit de ferramentas In-Cloning

O estudo atual descreve um fluxo de trabalho para sequenciamento nanoporoso de plasmídeos quando a sequência cromossômica já é conhecida ou não tem interesse. Uma etapa inicial de enriquecimento de DNA plasmídico garante a profundidade ótima da sequência plasmídica e maximiza o número de amostras que podem ser sequenciadas por célula de fluxo.

Sequenciamento e montagem de plasmídeos de leitura longa usando fluxos de trabalho baseados em sequenciamento nanopore

Aprenda a montagem in vivo para clonagem de DNA com alta eficiência em E. coli. Este método elimina enzimas especializadas, reduzindo custos e tempo na pesquisa genética.

Uso de montagem in vivo para construção de plasmídeo de alta eficiência

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