Name: Análise de subpopulações plaquetárias por citometria de fluxo multicolorida (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Aprenda a analisar subpopulações plaquetárias por citometria de fluxo multicolorida usando agonistas específicos. Este método computacional identifica 27 clusters distintos e padrões de ativação únicos para estudo de trombose e inflamação.

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<ol><li>Freedman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+platelet-dependent+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of platelet-dependent thrombosis.</a> Circulation. 112 (17), 2725-2734 (2005).</li>
<li>Koupenova, M., Kehrel, B. E., Corkrey, H. A., Freedman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombosis+and+platelets%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Thrombosis and platelets: an update.</a> Eur Heart J. 38 (11), 785-791 (2016).</li>
<li>van der Meijden, P. E. J., Heemskerk, J. W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+biology+and+functions%3A+new+concepts+and+clinical+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Platelet biology and functions: new concepts and clinical perspectives.</a> Nat Rev Cardiol. 16 (3), 166-179 (2019).</li>
<li>Li, Z., Delaney, M. K., O'Brien, K. A., Du, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+During+Platelet+Adhesion+and+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscl+Thrombosis+Vas+Biol%22%5BJournal%5D)">Signaling During Platelet Adhesion and Activation.</a> Arterioscl Thrombosis Vas Biol. 30 (12), 2341-2349 (2010).</li>
<li>Oishi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heme+activates+platelets+and+exacerbates+rhabdomyolysis-induced+acute+kidney+injury+via+CLEC-2+and+GPVI%2FFcRgamma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Adv%22%5BJournal%5D)">Heme activates platelets and exacerbates rhabdomyolysis-induced acute kidney injury via CLEC-2 and GPVI/FcRgamma.</a> Blood Adv. 5 (7), 2017-2026 (2021).</li>
<li>Bourne, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heme+induces+human+and+mouse+platelet+activation+through+C-type-lectin-like+receptor-2%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Heme induces human and mouse platelet activation through C-type-lectin-like receptor-2.</a> Haematologica. 106 (2), 626-629 (2021).</li>
<li>Rohlfing, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cGMP+modulates+hemin-mediated+platelet+death%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">cGMP modulates hemin-mediated platelet death.</a> Thromb Res. 234, 63-74 (2024).</li>
<li>Chu, Y., Guo, H., Zhang, Y., Qiao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procoagulant+platelets%3A+Generation%2C+characteristics%2C+and+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Lab+Anal%22%5BJournal%5D)">Procoagulant platelets: Generation, characteristics, and therapeutic target.</a> J Clin Lab Anal. 35 (5), e23750(2021).</li>
<li>Sodergren, A. L., Ramstrom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+subpopulations+remain+despite+strong+dual+agonist+stimulation+and+can+be+characterised+using+a+novel+six-colour+flow+cytometry+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Platelet subpopulations remain despite strong dual agonist stimulation and can be characterised using a novel six-colour flow cytometry protocol.</a> Sci Rep. 8 (1), 1441(2018).</li>
<li>Agbani, E. O., Poole, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procoagulant+platelets%3A+generation%2C+function%2C+and+therapeutic+targeting+in+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Procoagulant platelets: generation, function, and therapeutic targeting in thrombosis.</a> Blood. 130 (20), 2171-2179 (2017).</li>
<li>Agbani, E. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+Membrane+Ballooning+and+Procoagulant+Spreading+in+Human+Platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Coordinated Membrane Ballooning and Procoagulant Spreading in Human Platelets.</a> Circulation. 132 (15), 1414-1424 (2015).</li>
<li>Heemskerk, J. W., Mattheij, N. J., Cosemans, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-based+coagulation%3A+different+populations%2C+different+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Platelet-based coagulation: different populations, different functions.</a> J Thromb Haemost. 11 (1), 2-16 (2013).</li>
<li>Rukoyatkina, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifaceted+effects+of+arachidonic+acid+and+interaction+with+cyclic+nucleotides+in+human+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">Multifaceted effects of arachidonic acid and interaction with cyclic nucleotides in human platelets.</a> Thromb Res. 171, 22-30 (2018).</li>
<li>Taylor, M. L., Misso, N. L. A., Stewart, G. A., Thompson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Expression+of+Platelet+Activation+Markers+CD62P+and+CD63+Following+Stimulation+with+PAF%2C+Arachidonic+Acid+and+Collagen%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Differential Expression of Platelet Activation Markers CD62P and CD63 Following Stimulation with PAF, Arachidonic Acid and Collagen.</a> Platelets. 6 (6), 394-401 (1995).</li>
<li>van Velzen, J. F., Laros-van Gorkom, B. A., Pop, G. A., van Heerde, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+flow+cytometry+for+evaluation+of+platelet+surface+antigens+and+activation+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">Multicolor flow cytometry for evaluation of platelet surface antigens and activation markers.</a> Thromb Res. 130 (1), 92-98 (2012).</li>
<li>Hindle, M. S., Spurgeon, B. E. J., Cheah, L. T., Webb, B. A., Naseem, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidimensional+flow+cytometry+reveals+novel+platelet+subpopulations+in+response+to+prostacyclin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Multidimensional flow cytometry reveals novel platelet subpopulations in response to prostacyclin.</a> J Thromb Haemost. 19 (7), 1800-1812 (2021).</li>
<li>Johnson, L., Lei, P., Waters, L., Padula, M. P., Marks, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+platelet+subpopulations+in+cryopreserved+platelet+components+using+multi-colour+imaging+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Identification of platelet subpopulations in cryopreserved platelet components using multi-colour imaging flow cytometry.</a> Sci Rep. 13 (1), 1221(2023).</li>
<li>Laspa, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemin-induced+platelet+activation+is+regulated+by+the+ACKR3+chemokine+surface+receptor+and+has+implications+for+passivation+of+vulnerable+atherosclerotic+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Hemin-induced platelet activation is regulated by the ACKR3 chemokine surface receptor and has implications for passivation of vulnerable atherosclerotic plaques.</a> FEBS J. 291 (24), 5420-5434 (2024).</li>
<li>Mueller, K. A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+Migration+Inhibitory+Factor+Promotes+Thromboinflammation+and+Predicts+Fast+Progression+of+Aortic+Stenosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Macrophage Migration Inhibitory Factor Promotes Thromboinflammation and Predicts Fast Progression of Aortic Stenosis.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 44 (9), 2118-2135 (2024).</li>
<li>Jourdi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consensus+report+on+flow+cytometry+for+platelet+function+testing+in+thrombocytopenic+patients%3A+communication+from+the+SSC+of+the+ISTH%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Consensus report on flow cytometry for platelet function testing in thrombocytopenic patients: communication from the SSC of the ISTH.</a> J Thromb Haemost. 21 (10), 2941-2952 (2023).</li>
<li>Flores-Montero, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorochrome+choices+for+multi-color+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Meth%22%5BJournal%5D)">Fluorochrome choices for multi-color flow cytometry.</a> J Immunol Meth. 475, 112618(2019).</li>
<li>Clemetson, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+of+CCR1%2C+CCR3%2C+CCR4%2C+and+CXCR4+chemokine+receptors+on+human+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Functional expression of CCR1, CCR3, CCR4, and CXCR4 chemokine receptors on human platelets.</a> Blood. 96 (13), 4046-4054 (2000).</li>
<li>Rohlfing, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ACKR3+regulates+platelet+activation+and+ischemia-reperfusion+tissue+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">ACKR3 regulates platelet activation and ischemia-reperfusion tissue injury.</a> Nat Commun. 13 (1), 1823(2022).</li>
<li>Rath, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+stromal+cell-derived+factor-1+receptors+CXCR4+and+CXCR7+on+circulating+platelets+of+patients+with+acute+coronary+syndrome+and+association+with+left+ventricular+functional+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Expression of stromal cell-derived factor-1 receptors CXCR4 and CXCR7 on circulating platelets of patients with acute coronary syndrome and association with left ventricular functional recovery.</a> Eur Heart J. 35 (6), 386-394 (2014).</li>
<li>Hashemzadeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+review+of+the+ten+main+platelet+receptors+involved+in+platelet+activity+and+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Blood+Res%22%5BJournal%5D)">A comprehensive review of the ten main platelet receptors involved in platelet activity and cardiovascular disease.</a> Am J Blood Res. 13 (6), 168-188 (2023).</li>
<li>Moroi, M., Farndale, R. W., Jung, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation-induced+changes+in+platelet+surface+receptor+expression+and+the+contribution+of+the+large-platelet+subpopulation+to+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Pract+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Activation-induced changes in platelet surface receptor expression and the contribution of the large-platelet subpopulation to activation.</a> Res Pract Thromb Haemost. 4 (2), 285-297 (2020).</li>
<li>Busuttil-Crellin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+panel+design%2C+optimization%2C+and+performance+of+whole+blood+multi-color+flow+cytometry+of+platelet+surface+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Guidelines for panel design, optimization, and performance of whole blood multi-color flow cytometry of platelet surface markers.</a> Platelets. 31 (7), 845-852 (2020).</li>
<li>Fink, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Subtilisin-Like+Protease+Furin+Regulates+Hemin-Dependent+Ectodomain+Shedding+of+Glycoprotein+VI%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">The Subtilisin-Like Protease Furin Regulates Hemin-Dependent Ectodomain Shedding of Glycoprotein VI.</a> Thromb Haemost. 123 (7), 679-691 (2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>10x Buffer de Ligação&nbsp; &nbsp;</td><td>Invitrogen, Carlsbad, Califórnia, EUA</td><td>88-8103-74</td><td>Buffer&nbsp;</td></tr><tr><td>Difosfato de adenosina (ADP)</td><td>Probe & go Labordiagnostica GmbH Lemgo, Alemanha&nbsp; &nbsp;</td><td>70212</td><td>Agonista plaquetário&nbsp;</td></tr><tr><td>Anexina V PE-Cyanine7</td><td>Invitrogen, Carlsbad, Califórnia, EUA</td><td>88-8103-74</td><td>corante&nbsp;</td></tr><tr><td>anti-CD41 AF 700</td><td>BioLegend, San Diego, CA, EUA</td><td>303728</td><td>anticorpo&nbsp;</td></tr><tr><td>anti-CD41 Alexa Fluor 700</td><td>BioLegend, San Diego, CA, EUA</td><td>303727</td><td>anticorpo&nbsp;</td></tr><tr><td>anti-CD42b PerCP/Cianina5.5&nbsp;</td><td>BioLegend, San Diego, CA, EUA</td><td>303918</td><td>anticorpo&nbsp;</td></tr><tr><td>anti-CD61 BV605</td><td>BD Bioscience Franklin Lakes, NJ, EUA&nbsp;</td><td>744382</td><td>anticorpo&nbsp;</td></tr><tr><td>anti-CD62P PE</td><td>Beckman Coulter, Brea, Califórnia, EUA</td><td>IM1759U</td><td>anticorpo&nbsp;</td></tr><tr><td>anti-CD63 PE/Cy5&nbsp;</td><td>Abcam, Cambrigde, UK</td><td>ab 234251</td><td>anticorpo&nbsp;</td></tr><tr><td>anti-CXCR4 BV650</td><td>BD Bioscience Franklin Lakes, NJ, EUA</td><td>740599</td><td>anticorpo&nbsp;</td></tr><tr><td>anti-CXCR7 BV421&nbsp;</td><td>BD Bioscience Franklin Lakes, NJ, EUA&nbsp;</td><td>566234</td><td>anticorpo&nbsp;</td></tr><tr><td>anti-PAC-1 FITC</td><td>BD Bioscience Franklin Lakes, NJ, EUA</td><td>340507</td><td>anticorpo&nbsp;</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Applichem, Darmstadt, Alemanha</td><td>A1391-Ácido</td><td></td></tr> <tr><td>citrital&nbsp;</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha</td><td>6490.1-CRP-XL</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>CambCol Laboratories, Ely, Reino Unido</td><td>CRP-XL</td><td>agonista plaquetário&nbsp;</td></tr><tr><td>D-(+)-Glicose</td><td>Sigma Aldrich Co., St. Louis, Missouri, EUA</td><td>G7528-Dubecco</td><td></td></tr><tr><td>' s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Sigma Aldrich Co, St. Louis, Missouri, USA</td><td>D8537-Hemin</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich Co., St. Louis, Missouri, EUA</td><td>Agonista plaquetário</td> <td>H9039-10G</td>&nbsp;</tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha</td><td>9105.3-Cloreto</td> <td>de</td></tr> <tr><td>potássio&nbsp;</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha</td><td>6781.3-Cloreto</td> <td>de</td></tr> <tr><td>sódio&nbsp;</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha</td><td>3957.1-Hidrogenocarbonato</td> <td>de</td></tr> <tr><td>sódio&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma Aldrich Co, St. Louis, Missouri, EUA</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>401676-Trombina&nbsp;</td><td>Roche&nbsp;</td><td>10602400001</td><td>agonista plaquetário&nbsp;</td></tr><tr><td>citrato-di-hidrato tri-sódico&nbsp;</td><td>Applichem, Darmstadt, Alemanha</td><td></td> <td>1416551211-Zombie</td></tr> <tr><td>NIR</td><td>BioLegend, San Diego, CA, EUA</td><td>423105</td><td>corante reativo à amina&nbsp;</td></tr></tbody></table>

análise de subpopulações plaquetárias por citometria de fluxo multicolorida

Analyzing Platelet Subpopulations by Multi-color Flow Cytometry

Existem duas opções para analisar os dados brutos coletados por um painel de citometria de fluxo multicolorido. Uma opção é analisá-lo manualmente com o software de análise (Figura 3 e Figura 4). Portanto, os dados brutos precisam ser arrastados e soltos na janela do software. Primeiro, as células precisam ser encontradas ajustando a escala SSC/FSC no modo de exibição do gráfico de dispersão para mostrar a população de plaquetas como uma nuvem de pontos distinta...

Análise de subpopulações plaquetárias por citometria de fluxo multicolorida

Platelets, or thrombocytes, are small anucleated blood cells that play a crucial role in hemostasis and thrombosis. Defects in platelet functions can ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Neste relatório, demonstrar os passos coloração e análise de um ensaio de fenotipagem em sangue total fresco para enumerar grandes inata e adaptativa populações de leucócitos. Ressaltamos considerações para executar estes procedimentos, no contexto de um ensaio clínico multicêntrico.

Enumeração dos principais Populações de Leucócitos do Sangue Periférico de ensaios clínicos multicêntricos usando um ensaio fenotipagem Sangue

Este trabalho descreve um método baseado em microscopia de fluorescência para o estudo da adesão, disseminação e secreção de plaquetas sob fluxo. Esta plataforma versátil permite a investigação da função plaquetária para pesquisas mecanicistas sobre trombose e hemostasia.

Imagens de células vivas de degradação e secreção de plaquetas sob fluxo

Aqui, apresentamos um protocolo de fluxo cytometric para identificar CD4+ e CD8+ T células, as células γδ T, células B, células NK e monócitos no sangue periférico humano usando apenas dois fluorochromes em vez de sete. Com esta abordagem, cinco marcadores adicionais podem ser gravadas na maioria dos citômetros.

Discriminação de sete subconjuntos de células imunes por dois-fluorocromo citometria de fluxo

Aqui, o sangue do rato foi coletado na presença de um anticoagulante. As plaquetas foram purificadas por meio de gradiente iohexol utilizando centrifugação de baixa velocidade. As plaquetas foram ativadas com trombina para investigar se eram viáveis. A qualidade das plaquetas purificadas foi analisada por citometria de fluxo e microscopia.

Purificação de plaquetas de sangue de rato

Este protocolo descreve em detalhes todas as etapas envolvidas na obtenção de progenitores hematopoiéticos derivados de leucofilter e sua diferenciação in vitro e maturação em megacaiócitos portadores de proplatelet que são capazes de liberar plaquetas no meio da cultura. Este procedimento é útil para uma análise aprofundada dos mecanismos celulares e moleculares que controlam a megacaripoiese.

Leukodepletion Filters-Derived CD34+ Cells As a Cell Source to Study Megakaryocyte Diferenciação e Formação de Plaquetas

Apresentamos aqui uma técnica baseada em citometria de fluxo que permite medir simultaneamente o número de divisões celulares, o fenótipo celular de superfície e o parentesco celular. Essas propriedades podem ser testadas estatisticamente usando uma estrutura baseada em permutação.

Avaliação Simultânea de Parentesco, Número de Divisão e Fenótipo por Citometria de Fluxo para Células-Tronco Hematopoéticas e Progenitoras

A formação de plaquetas pró-coagulantes tem sido correlacionada com um risco aumentado de trombose. Apresenta-se aqui um protocolo preciso para isolar plaquetas lavadas do sangue humano, destinado a quantificar a exposição à fosfatidilserina e a liberação de microvesículas, que são características distintivas das plaquetas pró-coagulantes.

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Este artigo descreve o protocolo para quantificar a porcentagem de plaquetas positivas para o Fator Tissular (TF) usando citometria de fluxo sanguíneo total, avaliando a proteína: (1) intracelularmente em condições de repouso, e (2) na superfície celular, tanto em repouso quanto em condições ativadas. Também é fornecida orientação para avaliar plaquetas TF-positivas em plasma rico em plaquetas.

Análise por Citometria de Fluxo da Expressão de Fatores Tecidusuais em Plaquetas Humanas

O presente protocolo fornece um conjunto abrangente de procedimentos necessários para analisar plaquetas pró-coagulantes, que exibem características sobrepostas de necrose, apoptose e ativação plaquetária.

Análise abrangente de plaquetas pró-coagulantes exibindo características de necrose, apoptose e ativação plaquetária

Este artigo descreve um método para estudar o metabolismo celular em comunidades complexas de vários tipos de células, usando uma combinação de rastreamento de isótopos estáveis, classificação de células para isolar tipos específicos de células e espectrometria de massa.

Um método para medir o metabolismo em Ordenado subpopulações de Comunidades celulares complexas usando Stable Isotope Tracing

Aprenda a analisar subpopulações plaquetárias por citometria de fluxo multicolorida usando agonistas específicos. Este método computacional identifica 27 clusters distintos e padrões de ativação únicos para estudo de trombose e inflamação.

Análise de subpopulações plaquetárias por citometria de fluxo multicolorida

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