Análise de subpopulações plaquetárias por citometria de fluxo multicolorida

Nossa pesquisa utiliza citometria de fluxo multicolorida para identificar e caracterizar subpopulações plaquetárias, com o objetivo de entender os papéis, padrões de ativação e relevância clínica no contexto específico de trombose, inflamação e doença. O ensaio de citometria de fluxo multicolorido estabelecido permitiu observar o , um agonista plaquetário induz um padrão de ativação distinto e comparado ao peptídeo relacionado ao colágeno gera um pró-coagulante e de subpopulação. O ensaio multicolorido permite a medição simultânea da ativação plaquetária, adesão, agregação e potencial apoptótico de uma única plaqueta dentro de uma população de plaquetas humanas isoladas em um único tubo.

[Instrutor] Para começar, prepare todos os reagentes necessários para o procedimento. Agora, misture 10 mililitros de tampão 10x Tyrode com 90 mililitros de água destilada. Adicione 0,1 grama de glicose e ajuste o pH do volume total com hepes para chegar a 7,4. Primeiro, defina o pH de 10 mililitros do tampão para 7,4 e, em seguida, ajuste o pH dos 90 mililitros restantes com um ácido clorídrico normal para 6,5. Para a coleta de amostras de sangue, prepare uma seringa de 10 mililitros para cada doador com dois mililitros de anticoagulante ACD. Deixe a seringa equilibrar à temperatura ambiente. Depois de coletar o sangue do doador em uma seringa de DAC pré-aquecida, transfira lentamente o sangue tratado com DAC para um tubo de reação de 15 mililitros. Centrifugue o sangue tratado com ACD a 209G por 20 minutos em temperatura ambiente sem usar o intervalo. Enquanto isso, prepare 25 mililitros de tampão Hepes de Tyrode, pH 6,5 em um tubo de reação de 50 mililitros. Após a centrifugação, transfira suavemente a camada superior de plasma rico em plaquetas para o tubo que contém o tampão Hepes de Tyrode. Para evitar a contaminação, deixe aproximadamente um mililitro de plasma rico em plaquetas acima do revestimento leucocitário e da camada eritrocitária. Em seguida, centrifugue a suspensão a 430G por 10 minutos em temperatura ambiente para pellet as plaquetas. Descarte o sobrenadante e ressuspenda cuidadosamente o sedimento de plaquetas em 200 a 300 microlitros de tampão Tyrode, ajustado para pH 7,4. Meça a contagem de plaquetas usando um contador de células antes de ajustá-la para 200.000 plaquetas por microlitro com o tampão Hepes de Tyrode em pH 7,4. Para receptores que não requerem ativação antes da coloração, incluindo CD61, CD42B, CD41, CXCR7 e CXCR4, prepare uma amostra não corada e uma corada por anticorpo. Para receptores ou marcadores que requerem ativação, como PAC-1, CD63, CD62P, NXN5 e NIR zumbi. Ativar a amostra com 10 microgramas por mililitro de CRPXL e preparar as amostras ativadas e não ativadas. Para ativar as plaquetas, incube-as com 10 microgramas por mililitro de CRPXL por 30 minutos. Em seguida, incube a plaqueta isolada com concentrações variáveis do anticorpo conjugado com fluorocromo ou morra por 30 minutos. Em seguida, adicione 300 microlitros de tampão de ligação de anexina a cada amostra para diluí-la. Meça 10.000 eventos para cada amostra usando um citômetro de fluxo. Calcule o índice de coloração para cada anticorpo para determinar a separação ideal entre populações positivas e negativas. Plote o índice de coloração em relação às concentrações de anticorpos para identificar a concentração ideal para cada anticorpo Para coloração, dissolva o pó de hemen em hidróxido de sódio 1.4M para criar uma solução 3M. Aquecer a solução a 96 graus Celsius durante cinco minutos a 450 rotações por minuto. Diluí-lo com água destilada para obter uma solução de caule de três milimolares. Depois de ajustar a contagem de plaquetas para 1 milhão de plaquetas por amostra, ative as plaquetas conforme demonstrado anteriormente. Adicione 43,3 microlitros de coquetel de anticorpos a cada amostra e incube-os por 30 minutos em temperatura ambiente no escuro. Após a incubação, dilua cada amostra com 300 microlitros de um X e X em tampão de ligação composto por hidróxido de sódio Hepes de 10 milimolares a pH 7,4. Medir imediatamente cada amostra corada com o citómetro de fluxo. Para compensação com grânulos, prepare 150 microlitros de PBS para cada fluoróforo e adicione uma gota de grânulos e um microlitro do anticorpo conjugado com fluorescência. Para compensar a anexina V, use PECY7B sete esferas marcadas com CD 62L anti-humano conjugado ao mesmo fluoróforo da anexina V. Use contas de compensação reativas de amina para o corante reativo de amina misturando duas gotas de contas positivas e uma gota de contas negativas em 150 microlitros de PBS com um microlitro de matriz. Confirme se os grânulos positivos reagem e exibem um sinal e os grânulos negativos não. Prepare uma fluorescência menos um controle para cada marcador. Os gráficos de dispersão mostraram uma clara mudança na população de plaquetas. Com hemina formando mais plaquetas com baixa dispersão para a frente do que outros agonistas. O tratamento com ADP trombina e CRPXL resultou em 40 a 60% de plaquetas sendo CD42 positivas, enquanto a hemina reduziu significativamente essa população. Todos os agonistas plaquetários não tiveram efeito sobre a expressão superficial de CD41 e CD61. Apenas o hemen aumentou significativamente a expressão de superfície CXCR4 e CXCR7. Além disso, a exposição à fosfatidilserina também foi aumentada sob tratamento com hemina, resultando em um aumento das células positivas da anexina V. As análises de UMAP e gráfico de fenol definiram 27 aglomerados plaquetários distintos, que variaram com o tipo de agonista. Hemin causou a mudança mais dramática nos padrões de agrupamento. As subpopulações de plaquetas em repouso foram mais preservadas com ADP e alugadas com hemina.