Detecção de FISH sensível ao polimorfismo de nucleotídeo único da transcrição de RNA ribossômico específico do locus em Drosophila melanogaster

Nossa pesquisa se concentra em entender como as células detectam, monitoram e regulam os múltiplos loci de DNA ribossômico em seu genoma. Especificamente, pretendemos descobrir os mecanismos que distinguem quais loci de rDNA são ativamente transcritos e como esses loci são regulados individualmente. Recentemente, descobrimos que a quantidade de rDNA em uma célula pode mudar com o tempo e que essa mudança altera quais loci de rDNA são transcritos.

Agora entendemos que as células mudarão sua transcrição de rDNA com base na quantidade de rDNA que possuem. Essa descoberta nos leva a perguntar como as células sabem quanta RDA possuem e como determinam qual locus de rDNA preferem expressar. Nosso laboratório agora está focado em entender o mecanismo que as células usam para distinguir entre diferentes loci de rDNA e sentir e regular sua atividade.

Sob um estereomicroscópio, disseque Drosophila para isolar os testículos em PBS livre de RNase. Para começar, segure o meio do abdômen com um par de pinças e a extremidade do abdômen com outro par para separar suavemente o animal. Usando uma pinça, transfira os testículos isolados da placa de dissecação para um tubo de microfuga de 1,5 mililitro contendo 0,5 mililitros de PBS livre de RNase.

Aspire o PBS e adicione um mililitro de solução de fixação. Colocar a amostra num agitador de nutatas à temperatura ambiente durante 30 minutos. Após a incubação, aspirar a solução de fixação.

Em seguida, lave a amostra duas vezes com um mililitro de PBS por cinco minutos cada em um agitador nutatário. Depois de aspirar o PBS, adicione um mililitro de etanol a 70% livre de RNase e incube a amostra a quatro graus Celsius durante a noite em um agitador nutatário. Em seguida, aspirar o etanol e adicionar um mililitro de tampão de lavagem à amostra.

Incubar a amostra à temperatura ambiente num agitador de nutatas durante três minutos. Depois disso, deixe o tubo descansar na posição vertical por dois minutos. Misture as sondas e máscaras com o tampão de hibridização para preparar um volume total de 100 microlitros por amostra, conforme mostrado aqui.

Em seguida, adicione 100 microlitros de solução de hibridização à amostra após aspirar o tampão de lavagem. Aplique um filme transparente para selar as bordas do tubo. Enrole o tubo em papel alumínio para protegê-lo da luz e incube a amostra em banho-maria a 37 graus Celsius por pelo menos 24 horas.

Sem aspirar a solução de hibridização, adicione um mililitro de tampão de lavagem à amostra. Incubar a amostra em banho-maria a 37 graus Celsius por 30 minutos no escuro. Uma vez aspirado o tampão de lavagem, adicione um mililitro de tampão de lavagem fresco à amostra e incube novamente.

No final da incubação, aspire o tampão de lavagem e adicione 50 microlitros de meios de montagem à amostra. Sob um estereomicroscópio de dissecação, use uma pipeta para transferir a amostra para uma lâmina de microscópio. Usando uma pinça, organize os testículos em uma linha na lâmina do microscópio para facilitar a identificação da amostra durante a imagem.

Cubra a amostra com uma lamínula e seque as bordas da lamínula com um lenço de papel para remover o excesso de mídia de montagem. Sele as bordas da lamínula com esmalte e deixe-as no escuro em temperatura ambiente por 10 minutos para permitir que o esmalte seque. Os sinais de rRNA foram detectados no nucléolo, aparecendo como regiões de poros DAPI dentro do núcleo, particularmente em células germinativas com grandes núcleos e nucléolos.

Sinais fracos e inespecíficos foram observados no citoplasma em amostras sem loci de rRNA. Na maioria das células, os sinais de YrRNA foram detectados exclusivamente, indicando a transcrição de rRNA do locus YrDNA. A co-expressão de X e YrRNA foi observada em células germinativas, com sinais se fundindo em um único núcleo ou se separando em dois nucléolos.