Name: Detecção de FISH sensível ao polimorfismo de nucleotídeo único da transcrição de RNA ribossômico específico do locus em Drosophila melanogaster (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-28T14:50:00.000+00:00
Duration: 4 min 59 s
Description: Aprenda o método SNP-FISH para distinguir transcritos de rRNA de loci específicos de DNA ribossômico em Drosophila melanogaster. Esta técnica permite investigar a regulação seletiva da transcrição em nível celular.

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</ol>

<table><tbody><tr><td>PTC Tempo 96 Thermal Cycler</td><td>Bio Rad</td><td>12015382</td><td>Qualquer termociclador pode ser usado</td></tr><tr><td>0,2 mL 8 tiras flatcap PCR</td> tubos <td>VWR</td><td>89133-912</td><td>Qualquer tubo compatível pode ser usado</td></tr><tr><td>1 kb DNA ladder</td><td>NEB</td><td>N3232S</td><td>Para usar ao verificar sequenciamento PCR tamanho amplicon por eletroforese em gel</td></tr><tr><td>1,5 mL tubos de microcentrífuga graduados</td><td>EUA Scientific</td><td>1615-5510</td><td>Qualquer tubo certificado livre de RNase fará</td></tr><tr><td>2 mM dNTP Mix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0241</td><td></td></tr><tr><td>50x TAE Buffer</td><td>Bio Rad</td><td>1610743</td><td>Usado para eletroforese em gel. Qualquer tampão TAE pode ser usado.</td></tr><tr><td>5M NaCl</td><td></td><td></td><td>Qualquer NaCl pode ser usado ou preparado a partir de qualquer fonte</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>VWR</td><td>97064-250</td><td>Qualquer Agarose pode ser usado</td></tr><tr><td>ApE - Um plasmídeo Software Editor</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr> https://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/ <tr><td>Esmalte</td><td></td><td></td> transparente <td>Qualquer esmalte de qualquer varejista pode ser usado</td></tr><tr><td>Vidro de cobertura, Espessura nº 1</td><td>Thomas Scientific</td><td>6672A38</td><td></td></tr><tr><td>Deionized Formamida</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9569627</td><td></td></tr><tr><td>Dextran Sulfato de Sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8906-10G</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Green PCR Master Mix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K1081</td><td></td></tr><tr><td>Dumont # 5 Pinças</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td>Usado para dissecar amostras</td></tr><tr><td>EDTA (0,5 M), Ph 8,0</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R1021</td><td>Qualquer produto comparável pode ser usado</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR</td><td>89125-172</td><td>Qualquer etanol de 200 provas pode ser usado. Usado para diluição a 70% de etanol para permeabilização e limpeza para condições livres de Rnase</td></tr><tr><td>Brometo de Etídio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15585011</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Eletroforese Mini Gel Horizontal</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-170</td><td>Qualquer sistema de eletroforese em gel pode ser usado</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Teste Placa de Coloração</td><td>Eletrônica Microscopy Sciences</td><td>71564</td><td>Usado para dissecar amostras</td></tr><tr><td>Agitador de nutatas</td><td>Sigma Aldrich</td><td>BMSB3D1020</td><td>Qualquer agitador de nutatas pode ser usado</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>USA Scientific</td><td>3023-4526</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4, livre de RNase</td><td>Life Technologies</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 16% Formaldeído (p/v), sem metanol</td><td>Life Technologies</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Precision General Purpose Water Bath Life</td><td>Technologies</td><td>TSGP02</td><td>Qualquer banho-maria pode ser usado</td></tr><tr><td>Kit de extração de gel QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Qualquer kit de extração de gel pode ser usado</td></tr><tr><td>Solução de proteinase K recombinante (20 mg/mL)</td><td>Invitrogen</td><td>AM2546</td><td>Qualquer produto comparável pode ser usado</td></tr><tr><td>UltraPure BSA ThermoFisher Scientific sem Rnase</td><td></td><td>AM2618</td><td></td></tr><tr><td>S. cerevisiae tRNA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8759</td><td></td></tr><tr><td>SSC (20X), sem RNase</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM9763</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Life Technologies</td><td>A16046.AE</td><td></td></tr><tr><td>UltaPure 1M Tris-HCl Buffer, pH 7.5</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15567027</td><td>Qualquer produto comparável pode ser usado</td></tr><tr><td>Água destilada sem DNase/RNase UltraPure</td><td>Life Technologies</td><td>10977023</td><td></td></tr><tr><td>complexo de ribonucleosídeo vanadil</td><td>NEB</td><td>S1402S</td><td></td></tr><tr><td>Mídia de montagem VECTASHIELD com DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200-10</td><td></td></tr><tr><td>VWR Superfrost Microscope Slide</td><td>VWR</td><td>48311-601</td><td></td></tr><tr><td>y[1]w[1] Drosophila melanogaster line</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>1495</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 980 microscópio confocal</td><td>Microscopia Zeiss</td><td></td><td>Qualquer microscópio confocal com emissão e detecção compatíveis pode ser usado</td></tr><tr><td>Microscópio estéreo Zeiss Stemi 2000-C e microscópio de fonte de luz</td><td>Central</td><td>455053</td><td>Qualquer esteromicroscópio pode ser usado</td></tr></tbody></table>

detecção de fish sensível ao polimorfismo de nucleotídeo único da transcrição de rna ribossômico específico do locus em drosophila melanogaster

Single Nucleotide Polymorphism-sensitive FISH Detection of Locus-specific Ribosomal RNA Transcription in Drosophila melanogaster

Espera-se que os resultados do sequenciamento da genotipagem de SNP detectem diferenças de SNP entre os loci de rDNA X e Y. Esses SNPs são detectados avaliando diretamente as posições dos SNPs nos cromatogramas de sequenciamento (Figura 2). Espera-se que o sequenciamento de amostras femininas tenha um único sinal de sequenciamento na posição SNP, indicando homozigosidade SNP entre os dois cromossomos X (Figura 2A). Espera-se que os resultados do sequenciamento de amostras masculinas tenham um pico duplo na posição SNP (Figura 2B). Com base no genótipo do cromossomo X determinado a partir do sequenciamento da amostra feminina, a variante não-X é inferida como um SNP de rDNA do cromossomo Y (ou seja, X = T, Y = C para o sequenciamento do SNP 18S na Figura 2). Alternativamente, um único pico de sequenciamento em uma posição SNP na amostra masculina indicaria homozigosidade entre loci de rDNA masculino e feminino nessa posição SNP, e essa posição não seria utilizável para rRNA SNP-FISH.
Seguindo o protocolo para SNP FISH, as amostras podem ser visualizadas montando em lâminas e colocadas sob uma lamínula selada, seguida de microscopia confocal. Usando as sondas listadas na Tabela 3, o sinal de rRNA derivado de Y é detectado pela emissão de Alexa Fluor 647 e o sinal de rRNA derivado de X é detectado pela emissão de Alexa Fluor 488. Espera-se que os sinais de rRNA sejam observados no nucléolo, que pode ser identificado como o buraco pobre em DAPI no núcleo ( Figura 3A ). O nucléolo é particularmente fácil de identificar em células germinativas devido ao seu grande núcleo e nucléolo (Figura 3A). O sinal fraco normalmente também pode ser encontrado no citoplasma (Figura 3), mas este é um sinal inespecífico que também pode ser detectado em amostras sem rRNA contendo um SNP complementar (ou seja, sinal Y em células sem Y rDNA ou sinal X em células sem X rDNA; Figura 3B-C). Além disso, a co-marcação artificial de RNr X e Y às vezes pode ser detectada no centro somático, mesmo em amostras sem loci de rDNA X ou Y (Figura 3B-C, setas amarelas). Assim, apenas sinais nucleares devem ser usados para avaliar a transcrição específica do locus. Espera-se que a maioria das células, particularmente as células somáticas, tenha apenas um sinal Y rRNA, indicando que o rRNA é transcrito exclusivamente do locus Y rDNA (Figura 3A, círculo pontilhado amarelo e seta vermelha) 10 , 17 . No entanto, a co-expressão de rRNA X e Y é freqüentemente detectada em células germinativas, particularmente células-tronco germinativas13 (Figura 3A, círculos pontilhados brancos). Os sinais de rRNA X e Y em células que co-expressam podem ser adjacentes e formar um único nucléolo ( Figura 3A célula superior ) ou podem ser separados, formando dois nucléolos ( Figura 3A célula inferior ). Os exemplos na Figura 3 são fornecidos a partir do rDNA SNP-FISH usando conjuntos de sondas direcionados a apenas dois SNPs (os dois SNPs ITS1), demonstrando que apenas dois SNPs são necessários para o rDNA SNP-FISH. No entanto, sinais mais robustos são observados ao usar sondas direcionadas a todos os quatro SNPs13.
Os controles negativos são uma inclusão importante para este ensaio para confirmar que as sondas não reagem de forma cruzada com o alvo SNP errado, especialmente ao solucionar o problema do método pela primeira vez. Os controles negativos do cromossomo X incluem qualquer condição que não tenha rDNA do cromossomo X, como homens que abrigam um cromossomo X com deleção de rDNA. Espera-se que os controles negativos do cromossomo X detectem apenas o sinal Y rRNA e nenhum X rRNA (Figura 3B). Os controles negativos do cromossomo Y incluem qualquer condição que não tenha rDNA do cromossomo Y. Alguns exemplos dessas condições são quaisquer tecidos femininos XX, tecidos de homens sem cromossomo Y ou homens que abrigam um cromossomo Y com deleção de rDNA15. Espera-se que os controles negativos do cromossomo Y detectem apenas o sinal X rRNA e não tenham sinal Y rRNA detectável ( Figura 3C ). Observe que esses controles não são importantes apenas para determinar a especificidade da sonda, mas também para determinar qualquer fundo de sinal ou artefatos. Quaisquer novas sondas ou condições de ensaio que forneçam especificidade em tais controles podem ser usadas com precisão para detectar a transcrição de rDNA específica do locus.
Diferentes condições genéticas, de desenvolvimento ou ambientais podem alterar a probabilidade de que o rDNA seja transcrito exclusivamente do locus do rDNA do cromossomo Y 13,17. A frequência de transcrição do rDNA de um único locus ou de vários loci pode ser quantificada e comparada diretamente entre as amostras. Para comparar quantitativamente as diferenças na transcrição do locus do rDNA, cada célula deve ser categorizada individualmente como dominante em Y, codominante ou dominante em X. As células só são categorizadas como dominantes em Y e X se apenas o respectivo sinal for detectado. Qualquer célula com sinais de rRNA Y e X é considerada co-dominante, mesmo que um sinal seja muito mais fraco que o outro. Assim, as células que contêm sinais X e Y muito fortes são qualitativamente consideradas iguais às células com sinais Y forte e X fraco ou X forte e Y fraco. A porcentagem total de todas as células em todas as amostras em cada categoria pode ser comparada entre amostras pelo teste qui-quadrado. Embora este ensaio funcione bem para determinar qualitativamente se um determinado locus de rDNA é transcrito ou não, não observamos avaliações consistentes entre amostras ao quantificar diretamente a intensidade de fluorescência de sinais SNP-FISH individuais. Assim, não recomendamos fazer avaliações quantitativas da intensidade do sinal FISH entre amostras ou da intensidade relativa dos sinais X e Y rDNA dentro de uma única célula. A fonte dessa inconsistência na intensidade da fluorescência não é clara, embora possa ser devido à ligação ineficiente de sondas mascaradas que não se ligam a todos os rRNAs alvo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67881/67881fig01.jpg"> 
Figura 1: Diagrama do método SNP-FISH. (A) As sondas tradicionais de oligonucleotídeos antisense FISH reagem de forma cruzada com RNAs não-alvo que diferem em apenas um nucleotídeo. (B) O método SNP-FISH usa oligonucleotídeo de máscara complementar ligado à região 3 'da sonda de oligonucleotídeos. A máscara deixa apenas 10 nucleotídeos livres para se ligar à sequência alvo. Uma região de sonda não mascarada não se liga de forma estável a sequências não-alvo que diferem em um ou mais nucleotídeos. A máscara se dissocia da sonda após a sonda se ligar ao alvo, permitindo a ligação estável entre a sonda e o alvo. (C) Sondas SNP emparelhadas marcadas de forma diferente, combinadas com uma máscara comum, ligam especificamente alvos que diferem por um único nucleotídeo sem reação cruzada. (D) Várias sondas podem ser agrupadas para rotular especificamente haplótipos de rRNA distintos. Quatro diferenças de SNP foram caracterizadas entre os loci de rDNA X e Y na cepa y1w1 Drosophila melanogaster . Um SNP no rRNA 18S, um no rRNA 28S e dois na porção ITS1 do pré-rRNA. Os haplótipos de rRNA específicos de X e Y usados para SNP-FISH são exibidos. As sondas direcionadas à variante X rDNA nos quatro SNPs de rRNA são conjugadas a um fluoróforo comum (verde) e as sondas direcionadas às variantes Y rDNA são conjugadas a um fluoróforo diferente (magenta). Uma máscara comum é usada para cada SNP (quatro no total). A ligação da sonda específica do SNP em cada posição do SNP no rRNA pode rotular especificamente o rRNA dos loci de rDNA X e Y com até quatro sondas de oligonucleotídeos FISH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67881/67881fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67881/67881fig02.jpg"> 
Figura 2: Exemplos de resultados de sequenciamento de SNP de rDNA homozigotos e heterozigotos. Exemplo de sequenciamento de cromatogramas de 18S SNP sequenciamento de DNA de (A) amostras femininas e (B) masculinas. Posição do SNP 18S indicada por um asterisco (*). O sinal de timina (T) único para a posição SNP na amostra feminina indica uma timina na posição SNP no locus rDNA do cromossomo X. O sinal duplo na posição do SNP dividido entre timina e citosina (C) na amostra masculina indica uma citosina na posição do SNP no locus do rDNA do cromossomo Y (inferido pelo conhecimento de que a timina está no locus do cromossomo X). Os resultados do sequenciamento foram visualizados usando ApE - um software editor de plasmídeo19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67881/67881fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67881/67881fig03.jpg"> 
Figura 3: Exemplos de resultados de SNP-FISH no testículo de Drosophila usando apenas dois conjuntos de sondas SNP-FISH. Exemplos de SNP FISH no testículo de animais com (A) x e Y rDNA, (B) apenas Y rDNA ou (C) apenas X rDNA. Esses exemplos usaram apenas conjuntos de sondas rotulando os dois SNPs de rRNA ITS1, demonstrando que o rRNA SNP FISH funciona com apenas dois SNPs alvo. As células germinativas são identificadas por seu grande núcleo redondo e as células somáticas por seu núcleo menor e menos redondo. As células-tronco germinativas são identificadas por sua posição diretamente ao lado do centro somático, marcadas por um asterisco (*). As células germinativas que transcrevem o rDNA dos loci X e Y do rDNA são identificadas por sinais nucleares FISH X e Y (círculos pontilhados brancos, AA ''). As células germinativas que transcrevem DNA apenas do locus Y rDNA têm apenas um sinal FISH nuclear Y (círculo pontilhado amarelo). As células somáticas que expressam apenas Y são marcadas com uma seta vermelha. A co-marcação artificial de loci de rDNA X e Y pode ser observada no centro somático (seta amarela). A barra de escala é de 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67881/67881fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.</a>
Arquivo Suplementar 1: sequência de rRNA do locus do cromossomo X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67881/Dm_45S_rRNA.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Detecção de FISH sensível ao polimorfismo de nucleotídeo único da transcrição de RNA ribossômico específico do locus em Drosophila melanogaster

In order to ensure sufficient ribosomal RNA (rRNA) is transcribed for ribosome function, genomes contain hundreds of tandem duplications of the sequences ...

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Genética

Todo o Monte RNA Fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; A hibridação de<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriões

Nós descrevemos um protocolo robusto e versátil para a análise de arquitetura nuclear por FISH DNA 3D usando sondas fluorescentes diretamente marcadas.

Robust FISH DNA 3D utilizando sondas Diretamente rotuladas

PCR combinada com a análise de fusão de alta resolução (HRMA) é demonstrado como um método rápido e eficiente para a genotipagem de peixe-zebra.

Rápida e eficiente Zebrafish Genotipagem Usando PCR com alta resolução Análise Melt

O objetivo desta publicação é visualizar e discutir os passos operatórios de um protocolo de Northern Blot em RNA extraído de Drosophila melanogaster avançado embriões, células e tecidos. Este protocolo é particularmente útil para a detecção eficiente de espécies de ARN pequenas.

Aprimorada do Norte Detecção Blot de pequeno RNA de espécies em Drosophila melanogaster

A Purificação de Afinidade de Ribosssomos Traduzível (TRAP) é capaz de capturar a tradução específica do tipo de célula do mRNA. Aqui relatamos o primeiro protocolo TRAP dedicado ao isolamento de mRNA em populações de células raras de embriões de Drosophila.

TRAP-rc, Traduzindo Ribossomo Affinity Purificação de populações de células raras<em&gt; Drosophila</em&gt; Os embriões

O protocolo descrito de RNA em situ hibridização permite a detecção de RNA em toda Drosophila embriões ou tecidos dissecados. Usando placas de 96 poços da microplaca e amplificação do sinal de tyramide, transcrições podem ser detectadas no throughput, sensibilidade e alta resolução e a um custo relativamente baixo.

Alta resolução hibridação fluorescente In Situ em embriões da drosófila e tecidos usando amplificação de sinal Tyramide

Aqui, apresentamos um protocolo para a visualização, detecção, análise e rastreamento do tráfico endógeno de mRNA em câmara de ovo de Drosophila melanogaster ao vivo usando balizas moleculares, microscopia confocal de disco giratório e análise de código aberto Software.

Visualizando e rastreando mRNAs endógenas em câmaras de ovo de Drosophila melanogaster ao vivo

Fluorescência de RNA de molécula única in situ hibridização (smFISH) é um método para quantificar com precisão os níveis e a localização de RNAs específicos no nível único celular. Aqui, relatamos nossos protocolos de laboratório validados para processamento de banco molhado, imagem e análise de imagens para quantificação de células únicas de RNAs específicas.

Análise celular única de alelos ativos transcricionralmente por peixe de molécula única

Aqui, apresentamos um protocolo simplificado de marcação gênica endógena para Drosophila, que utiliza uma técnica baseada em PCR para identificação livre de marcadores de modificações genéticas bem-sucedidas, facilitando o desenvolvimento de linhagens estáveis.

Estratégia baseada em CRISPR em uma etapa para marcação gênica endógena em Drosophila melanogaster

Drosophila é um modelo bem estabelecido para estudar moléculas-chave que regulam a miogênese. No entanto, os métodos atuais são insuficientes para determinar a dinâmica transcricional do RNAm e a distribuição espacial dentro dos sincícios. Para resolver essa limitação, otimizamos um método de hibridização in situ por fluorescência de RNA, permitindo a detecção e quantificação de mRNAs em escala de molécula única.

Estudando a Dinâmica Transcricional Muscular em Escalas de Molécula Única em Drosophila

A hibridização in situ de fluorescência iterativa assistida por expansão (EASI-FISH) é uma técnica robusta que combina microscopia de expansão com hibridização in situ de fluorescência (FISH) para detectar a expressão de vários genes em tecidos espessos. Este protocolo descreve os recentes avanços no método e sua adaptação para rotular o sistema nervoso central intacto da Drosophila.

Detecção multiplex da expressão gênica no cérebro intacto de Drosophila usando hibridização in situ de fluorescência iterativa assistida por expansão

Aprenda o método SNP-FISH para distinguir transcritos de rRNA de loci específicos de DNA ribossômico em Drosophila melanogaster. Esta técnica permite investigar a regulação seletiva da transcrição em nível celular.

Detecção de FISH sensível ao polimorfismo de nucleotídeo único da transcrição de RNA ribossômico específico do locus em Drosophila melanogaster (Vídeo) | JoVE Journal

Detecção de FISH sensível ao polimorfismo de nucleotídeo único da transcrição de RNA ribossômico específico do locus em Drosophila melanogaster

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