Detecção de FISH sensível ao polimorfismo de nucleotídeo único da transcrição de RNA ribossômico específico do locus em Drosophila melanogaster
28 de março de 2025
O protocolo descreve o método de hibridização in situ de fluorescência sensível a polimorfismos de nucleotídeo único (SNP-FISH) para distinguir transcritos de RNA ribossômico derivados do locus de DNA ribossômico do cromossomo X ou Y em Drosophila melanogaster.
Nossa pesquisa se concentra em entender como as células detectam, monitoram e regulam os múltiplos loci de DNA ribossômico em seu genoma. Especificamente, pretendemos descobrir os mecanismos que distinguem quais loci de rDNA são ativamente transcritos e como esses loci são regulados individualmente. Recentemente, descobrimos que a quantidade de rDNA em uma célula pode mudar com o tempo e que essa mudança altera quais loci de rDNA são transcritos.
Agora entendemos que as células mudarão sua transcrição de rDNA com base na quantidade de rDNA que possuem. Essa descoberta nos leva a perguntar como as células sabem quanta RDA possuem e como determinam qual locus de rDNA preferem expressar. Nosso laboratório agora está focado em entender o mecanismo que as células usam para distinguir entre diferentes loci de rDNA e sentir e regular sua atividade.
Sob um estereomicroscópio, disseque Drosophila para isolar os testículos em PBS livre de RNase. Para começar, segure o meio do abdômen com um par de pinças e a extremidade do abdômen com outro par para separar suavemente o animal. Usando uma pinça, transfira os testículos isolados da placa de dissecação para um tubo de microfuga de 1,5 mililitro contendo 0,5 mililitros de PBS livre de RNase.
Aspire o PBS e adicione um mililitro de solução de fixação. Colocar a amostra num agitador de nutatas à temperatura ambiente durante 30 minutos. Após a incubação, aspirar a solução de fixação.
Em seguida, lave a amostra duas vezes com um mililitro de PBS por cinco minutos cada em um agitador nutatário. Depois de aspirar o PBS, adicione um mililitro de etanol a 70% livre de RNase e incube a amostra a quatro graus Celsius durante a noite em um agitador nutatário. Em seguida, aspirar o etanol e adicionar um mililitro de tampão de lavagem à amostra.
Incubar a amostra à temperatura ambiente num agitador de nutatas durante três minutos. Depois disso, deixe o tubo descansar na posição vertical por dois minutos. Misture as sondas e máscaras com o tampão de hibridização para preparar um volume total de 100 microlitros por amostra, conforme mostrado aqui.
Em seguida, adicione 100 microlitros de solução de hibridização à amostra após aspirar o tampão de lavagem. Aplique um filme transparente para selar as bordas do tubo. Enrole o tubo em papel alumínio para protegê-lo da luz e incube a amostra em banho-maria a 37 graus Celsius por pelo menos 24 horas.
Sem aspirar a solução de hibridização, adicione um mililitro de tampão de lavagem à amostra. Incubar a amostra em banho-maria a 37 graus Celsius por 30 minutos no escuro. Uma vez aspirado o tampão de lavagem, adicione um mililitro de tampão de lavagem fresco à amostra e incube novamente.
No final da incubação, aspire o tampão de lavagem e adicione 50 microlitros de meios de montagem à amostra. Sob um estereomicroscópio de dissecação, use uma pipeta para transferir a amostra para uma lâmina de microscópio. Usando uma pinça, organize os testículos em uma linha na lâmina do microscópio para facilitar a identificação da amostra durante a imagem.
Cubra a amostra com uma lamínula e seque as bordas da lamínula com um lenço de papel para remover o excesso de mídia de montagem. Sele as bordas da lamínula com esmalte e deixe-as no escuro em temperatura ambiente por 10 minutos para permitir que o esmalte seque. Os sinais de rRNA foram detectados no nucléolo, aparecendo como regiões de poros DAPI dentro do núcleo, particularmente em células germinativas com grandes núcleos e nucléolos.
Sinais fracos e inespecíficos foram observados no citoplasma em amostras sem loci de rRNA. Na maioria das células, os sinais de YrRNA foram detectados exclusivamente, indicando a transcrição de rRNA do locus YrDNA. A co-expressão de X e YrRNA foi observada em células germinativas, com sinais se fundindo em um único núcleo ou se separando em dois nucléolos.
Visão Geral
Este estudo apresenta um protocolo para hibridização fluorescente in situ sensível a polimorfismos de nucleotídeo único (SNP-FISH) capaz de diferenciar transcritos de RNA ribossomal provenientes dos locos de DNA ribossomal dos cromossomos X e Y em Drosophila melanogaster. A pesquisa tem como objetivo esclarecer os mecanismos pelos quais as células regulam e transcrevem diferentes locos de DNA ribossomal.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Genética
- Biologia Celular
Contexto
- As células monitoram e regulam os locos de DNA ribossômico em seu genoma.
- Compreender a regulação transcricional dos locos de DNA ribossômico é essencial.
- Descobertas recentes indicam que as quantidades de DNA ribossômico podem mudar ao longo do tempo.
- As células adaptam sua transcrição de DNA ribossômico com base na quantidade de DNA ribossômico presente.
Objetivo do Estudo
- Investigar como as células distinguem entre diferentes locos de rDNA.
- Compreender a regulação da transcrição de rDNA em resposta a condições celulares.
- Explorar os mecanismos de preferência de loco de rDNA durante a transcrição.
Métodos Utilizados
- Dissecação de Drosophila para isolamento dos testículos.
- Uso de PBS livre de RNase para preparação da amostra.
- Aplicação de soluções de fixação e hibridização.
- Detecção de sinais de rRNA utilizando microscopia de fluorescência.
Resultados Principais
- Sinais de rRNA foram detectados no nucléolo de células germinativas.
- A coexpressão de X e YrRNA foi observada em certas células.
- Padrões distintos de transcrição foram observados com base no locus rDNA.
- Sinais fracos foram encontrados em amostras que carecem de locos de rRNA.
Conclusões
- O método SNP-FISH distingue efetivamente os transcritos de rRNA.
- As células exibem transcrição seletiva com base na atividade do locus rDNA.
- Este estudo aprimora a compreensão da regulação de rDNA em Drosophila.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A discriminação da transcrição de RNA ribossomal específica por locus é fundamental para compreender a adaptação celular e a biogênese ribossomal em sistemas relevantes para doenças. A FISH sensível a SNP permite a visualização direta da atividade transcricional de rRNA a partir de loci genômicos distintos, apoiando a desmistificação mecanicista e a validação de alvos na fase inicial de descoberta. Essa capacidade aumenta a confiança preditiva para pesquisas translacionais e triagem de portfólios em contextos genéticos complexos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Permite a investigação da regulação transcricional de rRNA em locos específicos em células individuais.
- Apóia a validação funcional de mecanismos regulatórios que controlam a biogênese ribossomal.
- Facilita a redução de riscos mecanicistas ao distinguir fontes transcricionais em sistemas heterogêneos.
- Melhora a confiança preditiva para a priorização de alvos genéticos que afetam a função ribossomal.
Desenvolvimento de Ensaios e Triagem
- Oferece um ensaio validado para quantificar a produção de rRNA específico por locus em diversos tipos celulares.
- Permite a padronização de leituras para atividade transcricional de rRNA em diferentes condições experimentais.
- Permite a detecção reproduzível de alterações transcricionais em resposta a perturbações genéticas ou ambientais.
- Prepara sistemas biológicos para triagem subsequente de moduladores que afetam a atividade do locus de rDNA.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se com modelos relevantes para doenças em que o estresse ribossômico ou a troca de locus está implicada.
- Permite continuidade do descobrimento à validação pré-clínica por meio do rastreamento de alterações transcricionais específicas do locus.
- Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco ao fornecer dados transcricionais quantitativos com resolução por locus.
- Facilita o desenvolvimento de biomarcadores para disfunção ribossômica em estudos translacionais.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método SNP-FISH integra-se ao continuum de descoberta a pré-clínico ao permitir análise transcricional específica de locus, apoiando tanto testes de hipóteses quanto o desenvolvimento de ensaios quantitativos.
- Biologia da Descoberta: Fornece evidência direta de regulação transcricional específica do locus e esclarecimento de vias.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas e reprodutíveis da transcrição de rRNA a partir de loci individuais.
- Análises: Permite comparação estatística da atividade transcricional entre loci de rDNA em diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta alterações transcricionais específicas do locus a modelos de doenças e estratégias de biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma amplamente adaptável para análise transcricional resolvida por locus em diversos sistemas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na biologia ribossômica.
- Valor Operacional: Padroniza ensaios transcricionais específicos de locus para garantir reprodutibilidade e escalabilidade.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de prosseguir ou não ao esclarecer mecanismos regulatórios e fontes transcricionais.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de alvos e modelos com fenótipos transcricionais específicos de locus.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em hibridização fluorescente in situ e análise de célula única.
- Necessita de acesso a microscopia de fluorescência avançada e infraestrutura de análise de imagens.
- Exige padronização rigorosa entre equipes nos desenhos de sondas e protocolos de hibridização.
- A adaptação a outros sistemas modelo pode exigir otimização de sondas específica para o locus.
- A interpretação é limitada a sistemas com variantes de sequência de rRNA distinguíveis.
