Plataforma de imagem óptica multimodal para estudar o metabolismo celular
6 de junho de 2025
Utilizando uma plataforma multimodal que combina modalidades de imagem óptica sem rótulo, desenvolvemos um protocolo para visualizar e quantificar a dinâmica e o metabolismo celular. Por meio de imagens via fluorescência multifotônica, geração de segundo harmônico e microscopia de espalhamento Raman estimulada, podemos gerar uma visão holística do ambiente celular e molecular.
Nossa pesquisa envolve o uso de nosso microscópio multimodal para medir diferenças moleculares e metabólicas em várias patologias e visualizar sua heterogeneidade espacial. A abordagem multimodal da imagem óptica nos permite identificar alterações fisiopatológicas de várias perspectivas. A abordagem multimodal da microscopia óptica está continuamente expandindo suas aplicações, particularmente no ambiente clínico, onde o desenvolvimento de microendoscópios abriu um caminho para imagens clínicas.
Os desafios experimentais atuais residem na complexidade de incorporar todo o hardware entre si, o que é parte da razão pela qual utilizamos um sistema de microscópio personalizado. Por meio do uso de nossa plataforma de imagem óptica multimodal, fizemos avanços significativos no estudo de doenças bio-ortogonais sem rótulos, incluindo a classificação de diferentes subtipos de câncer de mama e a análise do metabolismo lipídico na drosófila e no cérebro de camundongos. Usando nossa imagem óptica multimodal sem rótulos, podemos visualizar o metabolismo, a morfologia e a composição molecular simultaneamente, o que é uma ferramenta poderosa para investigar doenças e o processo de envelhecimento.
Para começar, aqueça o laser e aguarde aproximadamente 15 a 20 minutos. Ligue a caixa de controle, seguida pelo controlador do painel de toque, adaptador CA para controle remoto do laser principal e adaptador CA para controle remoto do sublaser e, em seguida, ligue o detector de diodo fotográfico de silício e o amplificador de bloqueio. Configure o sistema de laser com um feixe de bomba ajustável de 780 nanômetros a 990 nanômetros, com uma largura de pulso de cinco a seis picossegundos e uma taxa de repetição de 80 megahertz.
O feixe de laser Stokes deve ter um comprimento de onda fixo de 1031 nanômetros, com um pulso de seis picossegundos e uma taxa de repetição de 80 megahertz. Certifique-se de que os feixes da bomba e dos alimentadores estejam em baixa potência, pelo menos 20 miliwatts visíveis na placa de alinhamento. Aplique óleo no condensador de óleo de alta abertura numérica.
Monte a lâmina do microscópio no condensador de óleo e coloque uma gota grande de água na lâmina do microscópio para a objetiva de água 25X. Ajuste o estágio Z para ajustar o foco até que a imagem de campo claro brilhante da amostra biológica seja visível sob a objetiva de água de 25X. Inicie o processo de imagem na sequência correta para evitar o fotobranqueamento.
Para alternar rapidamente entre MPF e SHG, mude do feixe da bomba para o feixe de stokes fixo. Selecione a resolução da imagem como 512 por 512 pixels. Defina o tempo de permanência como oito microssegundos por pixel para MPF e SHG, com um quadro médio acima de três.
Use 40 microssegundos por pixel com um quadro médio de dois para a modalidade SRS. Para adquirir autofluorescência com MPF, desligue o feixe de laser de stokes. Ajuste o laser da bomba para 800 nanômetros para excitar NADH e flavina.
Adquira o sinal da fibra de colágeno usando SHG. Desligue o feixe de laser da bomba e use apenas o feixe de laser stokes a uma potência de 500 miliwatts. Obtenha a distribuição espacial de proteínas e lipídios usando SRS.
Mantenha os dois feixes de laser ligados e ajuste a frequência do feixe de laser para corresponder ao modo vibracional específico de cada molécula. Para adquirir os conjuntos de dados de imagem hiperespectral SRS, selecione o modo de suíte e defina a faixa de comprimento de onda de 781,3 nanômetros a 806,5 nanômetros. Escolha um número de pilha de pelo menos 60 e capture a pilha de imagens hiperespectrais.
Salve todas as imagens das mesmas regiões de interesse na mesma pasta e certifique-se de que o formato da imagem seja o arquivo OIR da Olympus. A autofluorescência e a imagem SRS capturaram com sucesso informações metabólicas e estruturais do tecido pulmonar humano. A análise raciométrica da razão redox óptica e da razão de insaturação lipídica forneceu distribuições espaciais da atividade metabólica e da composição molecular no tecido pulmonar humano.
A comparação quantitativa do estresse oxidativo e da insaturação lipídica entre tecido saudável e tumoral revela diferenças nos estados metabólicos.
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Visão Geral
Este estudo apresenta uma plataforma de imagem óptica multimodal que permite a visualização e quantificação da dinâmica e do metabolismo celulares. Ao empregar diversas técnicas de imagem, podemos obter informações sobre o ambiente celular e molecular em diferentes patologias.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Imagem Óptica
Contexto
- A microscopia multimodal permite a medição de diferenças moleculares e metabólicas.
- Oferece uma visão abrangente das alterações fisiopatológicas.
- As aplicações estão se expandindo em ambientes clínicos, particularmente com microendoscópios.
- Sistemas personalizados de microscopia resolvem desafios experimentais.
Objetivo do Estudo
- Visualizar simultaneamente o metabolismo, a morfologia e a composição molecular.
- Investigar doenças e o processo de envelhecimento.
- Classificar diferentes subtipos de câncer de mama.
Métodos Utilizados
- Microscopia de fluorescência multiphoton
- Microscopia de geração de segunda harmônica
- Microscopia de espalhamento Raman estimulado
- Técnicas de imagem bioortogonal sem marcadores
Resultados Principais
- Avanços significativos na compreensão do metabolismo de lipídios em organismos modelo.
- Identificação da heterogeneidade espacial nas dinâmicas celulares.
- Classificação de subtipos de câncer de mama utilizando técnicas de imagem.
- Visualização aprimorada de processos metabólicos no cérebro.
Conclusões
- A abordagem multmodal é uma ferramenta poderosa para a investigação de doenças.
- Técnicas de imagem sem marcação fornecem insights abrangentes sobre ambientes celulares.
- Aplicações futuras podem aprimorar ainda mais as capacidades de imagem clínica.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Plataformas de imagem óptica multimodal que integram as modalidades MPF, SHG e SRS permitem a quantificação simultânea e sem marcadores do metabolismo celular, da morfologia e da composição molecular com resolução subcelular. Essa capacidade atende à necessidade crítica de dados metabólicos e estruturais com alto conteúdo e resolução espacial na pesquisa básica e translacional, apoiando a confiança preditiva em modelagem de doenças e desvio de mecanismos. A capacidade da plataforma de realizar o coregistro de múltiplas leituras funcionais a partir da mesma região biológica melhora a tomada de decisões em portfólios e o avanço ajustado ao risco.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a visualização direta e a quantificação da atividade metabólica e da heterogeneidade molecular em sistemas relevantes para doenças.
- Apoia a desvinculação mecanicista ao correlacionar estados metabólicos com características estruturais e composicionais.
- Facilita a validação funcional de alvos por meio de imagem multiplexada sem marcadores em células e tecidos vivos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Fornece saídas de imagem validadas e reprodutíveis para avaliação quantitativa de biomarcadores metabólicos e estruturais.
- Apóia a padronização de ensaios ao permitir a aquisição simultânea de múltiplas modalidades a partir da mesma região da amostra.
- Acelera a preparação para triagem ao reduzir a necessidade de marcadores exógenos e minimizar a perturbação da amostra.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha os resultados de imagem metabólica e molecular com a progressão da doença e a resposta terapêutica em modelos pré-clínicos.
- Permite o mapeamento espacial da heterogeneidade metabólica relevante para a biologia tumoral e a neurodegeneração.
- Apóia a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica, fornecendo leituras in situ e sem marcadores.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Esta plataforma de imagem multimodal integra a descoberta inicial, a identificação de compostos promissores e a pesquisa pré-clínica ao fornecer dados multiplexados e quantitativos de sistemas biológicos intactos.
- Biologia da Descoberta: Integra testes de hipóteses e esclarecimento de vias ao correlacionar dados metabólicos, estruturais e composicionais.
- Triagem: Fornece saídas de imagem quantitativas e reprodutíveis, adequadas para análise comparativa entre diferentes condições.
- Análises: Fornece medições ratiométricas e com resolução espacial do estresse oxidativo e da insaturação de lipídios para análise estatística robusta.
- Pesquisa Translacional: Permite alinhar biomarcadores de imagem com estados patológicos e resultados terapêuticos em sistemas modelo.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma capacidade de imagem escalonável e sem marcadores, adaptável a diversos modelos biológicos e áreas de doenças.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos e vias.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização, reprodutibilidade e escalabilidade dos fluxos de trabalho de imagem.
- Valor Estratégico: Melhora a tomada de decisões de avanço ou interrupção e a eficiência do capital ao fornecer dados multiplexados de alto conteúdo.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco e o avanço de programas de descoberta e pré-clínicos.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em imagem óptica avançada e integração de hardware multimodal.
- Exige instrumentação especializada, incluindo lasers sintonizáveis e sistemas de detecção sincronizados.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de imagem e das cadeias de análise de dados.
- A adaptação entre sistemas modelo pode exigir otimização dos parâmetros de imagem e do preparo das amostras.
- A complexidade da integração de hardware e do gerenciamento de dados pode limitar a produtividade em alguns ambientes.
