Imagem de super-resolução do biofilme de Proteus mirabilis por microscopia de expansão

O escopo de nossa pesquisa é fornecer à comunidade científica um método de super-resolução acessível para estudar a arquitetura, montagem e características intercelulares do biofilme proteus mirabilis além do limite refratário.

A microscopia quantitativa de biofilmes é desafiadora devido às limitações impostas pela resolução óptica. A microscopia de expansão de biofilme de Proteus mirabilis, ou PmbExM, contribuirá para uma melhor descrição e análise morfológica e topológica dessas complexas comunidades microbianas. Duas vantagens principais do PmbExM é que, primeiro, ele permite a visualização de super-resolução de biofilmes de proteus mirabilis usando microscópios convencionais limitados por refração e, segundo, não depende de rotinas complexas de processamento de dados pós-aquisição.

Nosso método facilita o estudo em nanoescala da estrutura e organização do biofilme para pesquisadores sem acesso a equipamentos especializados de super resolução e com experiência avançada em processamento ou análise digital de imagens.

O PmbExM permitirá a interrogação da arquitetura do biofilme proteus mirabilis, montagem, características celulares e intracelulares em nanoescala. Além disso, sua maleabilidade suporta adaptação e codificação para outras espécies de biofilme.

[Narrador] Para começar, adicione 400 microlitros de éster N-hidroxisuccinimidílico de ácido metacrílico de um milimolar, ou MA-NHS em PBS às amostras de biofilme coradas e incube-as em temperatura ambiente por uma hora com agitação leve. Após uma hora, lave suavemente as amostras de biofilme coradas três vezes com 300 microlitros de PBS em temperatura ambiente por 10 minutos cada. Remova o PBS e adicione 300 microlitros de solução de monômero às amostras. Incube durante a noite a quatro graus Celsius. Para construir as pré-câmaras de gelificação, use uma lâmina de vidro como base, depois corte, organize e prenda dois pedaços de fita dupla face dobrada na lâmina para atuar como espaçadores de 400 micrômetros. Organize câmaras úmidas para proteger as amostras da dessecação durante a polimerização. Agora, prepare um novo volume de estoque de solução gelificante misturando solução de monômero, 10% de tetrametiletilenodiamina, 0,5% de 4-Hidroxi-TEMPO e 10% de persulfato de amônio em uma proporção de 47 para 1 para 1 para 1. Imediatamente após preparar a solução gelificante, remova a solução monômera das amostras e substitua-a por 300 microlitros da solução gelificante. Incube as amostras a quatro graus Celsius por cinco minutos. Enquanto isso, remova a tampa protetora restante das tiras de fita dupla-face dispostas nas lâminas de vidro. Pipete 40 microlitros de solução gelificante entre os espaçadores. Quando a incubação da amostra estiver concluída, use uma pinça para levantar cada lamínula com biofilme e coloque-a em cima da gota de 40 microlitros de solução gelificante na lâmina. Oriente a lamínula de forma que o biofilme, em sua superfície, entre em contato com a solução gelificante. Termine a construção da câmara de gelificação pressionando suavemente a lamínula com biofilme com uma pinça para garantir a adesão aos espaçadores da fita. Coloque a câmara de gelificação montada dentro de uma câmara úmida para permitir a polimerização e incube a 37 graus Celsius sem agitação por duas horas. Após duas horas, desmonte as câmaras de gelificação e use uma lâmina cirúrgica para aparar o excesso de gel ao redor da região de interesse da amostra de biofilme. Coloque as lamínulas que transportam os géis aparados em uma nova placa de 24 poços com o lado do gel voltado para cima. Após a digestão enzimática das amostras gelificadas com solução de proteinase K, remova a solução de proteinase e transfira cada gel para uma placa de Petri separada de 60 milímetros para a expansão das amostras. Encha cada placa de Petri com excesso de água deionizada para que o gel fique totalmente submerso e incube sob agitação suave em temperatura ambiente por 20 minutos. Após completar a quinta troca de água, remova a água deionizada que cobre o gel. Use uma pequena escova plana para empurrar suavemente a amostra em uma lamínula de vidro de 24 por 50 milímetros. Remova o excesso de água do gel usando papel de seda. Coloque cuidadosamente o gel na superfície de vidro da câmara de imagem, garantindo que nenhuma bolha de ar fique presa entre o gel e o vidro. Finalmente, adicione água deionizada à câmara de imagem até que o gel esteja totalmente submerso. Análises quantitativas e espaciais foram utilizadas para avaliar a fidelidade de expansão e preservação morfológica de biofilmes de proteus mirabilis após microscopia de expansão de biofilme de proteus mirabilis, ou tratamento com PmbExM. A técnica PmbExM expandiu as estruturas do biofilme em aproximadamente 4,3 vezes, mantendo a morfologia celular e a organização topológica. Essa expansão aumentou significativamente a resolução visual das células bacterianas, tornando as estruturas celulares individuais mais nítidas e definidas. Com a resolução aprimorada, o PmbExM também permitiu a identificação clara de arranjos bacterianos em várias camadas dentro do biofilme que não foram resolvidos anteriormente. O PmbExM também facilitou a visualização de estruturas subcelulares anteriormente insolúveis, incluindo padrões distintos de organização do DNA. Esses padrões organizacionais foram confirmados por perfis de intensidade de linha, que revelaram vários picos de fluorescência distintos em amostras expandidas em comparação com o pico único observado em células não expandidas.