Estudo da morte celular programada induzida por nanopartículas de cobre em bactérias

Esta pesquisa investiga a eficácia bactericida nanopartical de cobre contra três bactérias comuns clinicamente significativas. Ele explora casos que incluem a geração de ROS e o potencial envolvimento da morte celular programada.

Um desafio atual é alcançar contagens consistentes de colônias. Acredito que isso decorre da intervenção. A modernização celular durante a diluição resulta em contagem falsa com localização em comparação com a contagem mais experiente.

Nosso grupo foi o primeiro a usar um modulador celular para estudar os mecanismos bactericidas das nanopartículas de cobre, revelando que a morte bacteriana envolve processos celulares como geração de ROS e autofagia.

O protocolo aborda a necessidade de uma compreensão mais profunda do mecanismo pelo qual as nanopartículas de cobre matam as bactérias, concentrando-se particularmente na área pouco explorada das vias de morte celular programada bacteriana.

Usando diferentes moduladores celulares, confirmamos que a morte bacteriana induzida por nanopartículas de cobre envolve autofagia e sobrecarga de ROS e identificamos as principais vias apoiadas por experimentos confiáveis baseados em triplicados com um design simples

[Narrador] Para começar, obtenha nanopós de cobre comerciais com diâmetros de 25 nanômetros e 60 a 80 nanômetros de um fornecedor comercial. Use um mililitro de um SDS milimolar como dispersante para cada tamanho de nanopartícula. Em seguida, disperse as nanopartículas usando um banho ultrassônico por pelo menos 30 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, obtenha cepas de Escherichia coli, Acinetobacter baumannii e Staphylococcus aureus dos respectivos centros de recursos biológicos. Cultive cada bactéria em 10 mililitros de caldo LB em condições aeróbicas a 37 graus Celsius. Dilua as culturas bacterianas em meio LB para atingir uma densidade óptica de aproximadamente 0,5 a 600 nanômetros. Agora use soluções de nanopartículas de cobre para preparar uma faixa de concentrações entre zero a 100 microgramas por mililitro de ambos os tamanhos. Pipete 500 microlitros das culturas bacterianas em tubos de microcentrífuga e centrifugue a 3.300 G por 10 minutos em temperatura ambiente. Depois de pipetar o sobrenadante, adicione diferentes concentrações de ambos os tamanhos das nanopartículas a cada tubo. Trate os grupos controle com 500 microlitros de PBS como controle negativo e 500 microlitros de álcool 70% como controle positivo. Em seguida, incubar todas as amostras com agitação a 200 rotações por minuto a 37 graus Celsius por 24 horas. Após a incubação, lave as bactérias com PBS e espalhe-as em placas de ágar LB. Incube as placas a 37 graus Celsius por 24 horas. No dia seguinte, conte as colônias em cada placa para todos os grupos de tratamento. Trate bactérias com cinco SBI micromolares por duas horas, necrossulfonamida 0,5 micromolar por uma hora, wortmannina 100 nanomolar por 30 minutos ou Z-VAD 100 nanomolar por 30 minutos. Após a conclusão de todo o pré-tratamento, centrifugue todos os tubos a 3.300 G por 10 minutos. Em seguida, ressuspenda o pellet em 800 microlitros de PBS para lavar o modulador de pré-tratamento. Distribua os pellets ressuspensos. Centrifugue cada tubo e descarte o sobrenadante. Ressuspenda os pellets em misturas moduladoras de nanopartículas antes de incubar com agitação. Agora adicione 70% de etanol e PBS como controles positivos e negativos. Inclua grupos de controle em branco tratados com inibidores, mas sem nanopartículas. Após a incubação, pipetar o reagente de viabilidade celular numa proporção de um para dez volumes e incubar. Depois de centrifugar novamente as culturas, transferir os sobrenadantes para placas de 96 poços. Meça a fluorescência com excitação de 560 nanômetros e emissão de 590 nanômetros usando um leitor de microplacas. Dilua os sobrenadantes restantes para 10 elevado a menos cinco e 10 elevado a menos quatro e espalhe em placas de ágar LB para cultura. Conte as colônias individuais no dia seguinte. Pipete culturas bacterianas em tubos de microcentrífuga. Em seguida, exponha as culturas à luz ultravioleta de 405 nanômetros por três horas. Em seguida, incube as culturas a 45 graus Celsius por duas horas. Em seguida, incube as bactérias a quatro graus Celsius por duas horas. Após o tratamento a frio, incube as bactérias em peróxido de hidrogênio a 3% por 30 minutos. Mantenha um grupo de controle a 37 graus Celsius em caldo LB. Agora trate bactérias com partículas de 20 ou 60 nanômetros em concentrações entre um a 100 microgramas por mililitro por 24 horas. Em seguida, lave as bactérias tratadas duas vezes com PBS. Após centrifugação, ressuspenda os grânulos bacterianos em uma solução de cinco micromolares de corante de diacetato de diclorodihidrofluoresceína 2',7'. Analise a intensidade de fluorescência com emissão de 520 ou 530 nanômetros. As contagens de colônias de Escherichia coli foram significativamente reduzidas em nanopartículas de cobre de 20 nanômetros a um micrograma por mililitro e em nanopartículas de cobre de 60 nanômetros a cinco microgramas por mililitro. Staphylococcus aureus mostrou reduções significativas na contagem de colônias em todas as concentrações de ambos os tamanhos de nanopartículas. Em Acinetobacter baumannii, as reduções no número de colônias exigiram cinco microgramas por mililitro de nanopartículas de cobre de 20 nanômetros e 10 microgramas por mililitro de nanopartículas de cobre de 60 nanômetros. Os tratamentos com nanopartículas de cobre induziram a produção de espécies reativas de oxigênio em todas as bactérias, com partículas de 20 nanômetros mostrando as maiores frações de células positivas em concentrações mais baixas. Em contraste, os tratamentos com nanopartículas de cobre de 60 nanômetros levaram à geração consistente de espécies reativas de oxigênio em todas as concentrações. O modulador de morte celular programado Z-VAD aumentou a sobrevida de Escherichia coli tratada com ambos os tamanhos de nanopartículas em concentrações baixas a moderadas. O tratamento com NSA melhorou a sobrevida de Staphylococcus aureus em todas as concentrações de nanopartículas de cobre de 20 nanômetros. Acinetobacter baumannii exibiu viabilidade aprimorada com Z-VAD sob um, cinco e 10 microgramas por mililitro de exposição a partículas de cobre de 20 e 60 nanômetros, enquanto a NSA aumentou a viabilidade em apenas 10 microgramas por mililitro de exposição a nanopartículas de cobre de 20 nanômetros.