Depleção rápida de macrófagos renais usando a ferramenta de ablação de células CD59/Intermedilisina humana

Usamos a oblação mediada por intermedilisina da célula que expressa CD59 humano em camundongos para estudar a regeneração de micrófagos renais, com foco na recuperação de monócitos impulsionada por quimiocina e no estabelecimento de nicho de vigilância imunológica pós-lesão. Desenvolvimentos recentes em nosso campo revelam mecanismo de regeneração de macrófagos renais, destacando uma quimiocina específica que recruta macrófagos e como a vigilância imunológica é restabelecida após lesão renal aguda. Combinamos criogenética induzível por tamoxifeno, ablação por intermedilisina, citometria de fluxo multiparâmetro e microscopia intravital para ablação, rastreamento e visualização de macrófagos renais em tempo real.

Os principais desafios são evitar a inflamação sistêmica, direcionar apenas os macrófagos residentes e medir a regeneração rápida sem perturbar o delicado microambiente renal. Mostramos que os monócitos restauram 88% dos macrófagos renais dentro de sete dias após a ablação, um processo criticamente dependente do eixo de sinalização CX3 CR1, CX3 CL1. Para começar, pré-aqueça o óleo de milho a 42 graus Celsius.

Dissolva 100 miligramas de tamoxifeno em cinco mililitros de óleo de milho pré-aquecido para preparar uma solução estoque com uma concentração de 20 miligramas por mililitro. Administre tamoxifeno por via intraperitoneal a camundongos machos de 10 a 12 semanas de idade na dose de 100 microgramas por grama de peso corporal. Após 15 dias, injetar uma dose intravenosa única de intermedilisina nos camundongos na dose de 120 nanogramas por grama de peso corporal.

Monitore e confirme a ablação de macrófagos residentes e a regeneração subsequente realizando citometria de fluxo em um, três e sete dias, após a administração de intermedilisina. Para coleta de rins, use pinças finas e tesouras para fazer uma incisão horizontal na região abdominal inferior de um camundongo sacrificado. Estenda a incisão verticalmente ao longo da linha média até logo abaixo da caixa torácica ou esterno.

Retraia suavemente a pele e o músculo para descobrir a cavidade torácica. Abra o átrio direito para permitir que o sangue seja drenado da circulação. Insira uma agulha de calibre 21 a 23 no ventrículo esquerdo.

Comece a perfusão com 10 a 20 mililitros de PBS frio para eliminar o sangue. Continue a perfusão até que os rins pareçam pálidos, indicando uma depuração sanguínea eficaz. Localize os rins contra a parede dorsal do corpo e separe-os suavemente dos tecidos circundantes usando uma pinça e uma tesoura.

Extirpar as cápsulas renais e colocar imediatamente os rins em PBS frio para evitar a degradação. Prepare 100 mililitros de coquetel de enzimas de digestão misturando HBSS sem cálcio e magnésio, colagenase IV e DNase I. Prepare a solução enzimática fresca e mantenha-a no gelo até o uso. Usando uma tesoura estéril, pique os rins em pequenos fragmentos em uma placa de Petri contendo cinco mililitros de HBSS.

Transfira o tecido renal picado para tubos de 15 mililitros contendo 10 mililitros da solução enzimática preparada. Agora incube os tubos a 37 graus Celsius por 30 minutos com agitação suave para dissociar o tecido. Triture suavemente o tecido usando uma pipeta ou êmbolo de seringa para quebrar ainda mais os aglomerados de células.

Remova os detritos passando a suspensão da célula por um filtro de célula de 40 micrômetros. Centrifugar a suspensão celular a 700 g durante 10 minutos a 18 graus Celsius. Em seguida, transvase cuidadosamente o tampão.

Ressuspenda o pellet em cinco mililitros de tampão de lise antes de incubar em temperatura ambiente por cinco minutos para lisar os glóbulos vermelhos. Adicione PBS para lavar as células e remover o tampão de lise. Mantenha a suspensão unicelular resultante no gelo até uso posterior.

Para centrifugação com gradiente de densidade, primeiro ressuspenda o pellet celular em 10 mililitros de solução de gradiente de densidade a 30%. Coloque cuidadosamente em camadas sobre três mililitros de solução de gradiente de densidade de 70% em um tubo de centrífuga. Centrifugar o gradiente a 500 G durante 30 minutos sem fazer pausa.

Após a centrifugação, colete cuidadosamente a camada de interface entre as soluções de 30% e 70%. Lave as células coletadas duas vezes com 10 mililitros de PBS e centrifugue cada lavagem a 500 G por 10 minutos. Ressuspenda o pellet celular final em um mililitro de tampão FACS em um tubo de 1,5 mililitro.

Conte as células usando um hemocitômetro sob um microscópio de campo claro e ajuste a concentração celular para duas vezes 10 elevado a seis células por mililitro. Pulverize as células em tubos de 1,5 mililitro centrifugando a 650 G por cinco minutos e ressuspenda o pellet celular em um mililitro de tampão FACS. Adicione anticorpo anti CD 16 ou 32 em uma diluição de um a 200 para bloquear a ligação inespecífica do receptor FC.

Depois de incubar as células por 15 minutos a quatro graus Celsius, corar as células com corante aqua vivo/morto e um coquetel de anticorpos pré-conjugados, incluindo CD45 E 450, CD11 B PE SI7, HCD59 PE e F4/80 BV 605. Adicione o coquetel de anticorpos diretamente à suspensão celular. Incube a amostra por 30 minutos a quatro graus Celsius no escuro para proteger os fluoróforos.

Em seguida, lave as células duas vezes com tampão FACS. Fixe as células em 1% de paraformaldeído por 30 minutos no gelo. Em seguida, lave as células duas vezes com tampão FACS para remover o fixador residual.

Adquira células coradas e fixas usando um citômetro de fluxo. Analise os dados usando o software. Identifique macrófagos e micróglias renais e outros tecidos residentes usando os marcadores CD45, CD11B e F4/80.

Execute o gating inicial para selecionar células ativas usando perfis de dispersão direta e lateral. Elimine os duplets usando a área de dispersão direta versus o controle de altura. Exclua as células mortas usando o corante de viabilidade.

Enriqueça as células imunológicas bloqueando populações CD45 positivas. Defina macrófagos residentes nos rins como células CD11b + F4 / 80hi dentro da porta CD45 positiva, conforme mostrado na estratégia de gating. Defina as populações de microglia como células intermediárias CD11b + CD45 e realize a análise final.

Uma única banda de proteína proeminente foi observada perto de 54 kilodalton no gel de página SDS, confirmando a pureza e o peso molecular esperado da intermedilisina recombinante. A intermedilisina purificada exibiu forte atividade hemolítica de maneira dose-dependente, atingindo 50% de lise de glóbulos vermelhos a 7,24 nanogramas por mililitro e lise quase completa a 650 nanogramas por mililitro. A análise por citometria de fluxo confirmou a depleção bem-sucedida e seletiva de macrófagos renais em camundongos cre-R compostos CD59 humanos induzíveis um dia após a administração de intermedilisina, sem depleção em camundongos controle.

Os macrófagos renais começaram a repovoar no terceiro dia e se recuperaram para aproximadamente 88% de sua população original no sétimo dia. Apenas 5% dos macrófagos renais recém-regenerados expressaram CD59 humano no sétimo dia, indicando que a repopulação ocorreu principalmente por meio do recrutamento de monócitos e não da proliferação in situ.