Name: Ensaios Comportamentais para Manipulação Optogenética de Circuitos Neurais em Drosophila melanogaster (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-07T14:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Aprenda ensaios comportamentais para manipulação optogenética de circuitos neurais em Drosophila melanogaster. Este método utiliza CsChrimson e GtACR2 para estudar comportamentos termotáticos e gustativos com precisão.

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1. Tensões, criação de moscas e aspirador de moscas
<ol>
	<li>Tensões e manutenção<ol>
		<li>As cepas usadas nos experimentos incluem HC-Gal410, Gr5a-Gal420 (Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC): 57592), Gr66a-Gal421 (BDSC: 57670), UAS-GtACR23, UAS-CsChrimson2 (BDSC: 55136). A traseira voa a 25 °C em um meio de fubá padrão sob um ciclo de luz de 12 horas: 12 horas. NOTA: 1 L de meio de fubá contém 1 L dH2O, 79 g de dextrose, 7,5 g de ágar, 24 g de fermento em flocos, 57 g de fubá, 2,1 g de metil-4-hidroxibenzoato (dissolvido em 11,1 mL de etanol), 6 g de tartarato de sódio e potássio tetrahidratado e 0,9 g de cloreto de cálcio.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Criação de moscas e preparação experimental<ol>
		<li>Classifique moscas de 0 a 3 dias. No momento da experimentação, as moscas terão de 3 a 6 dias de idade, garantindo consistência relacionada à idade (Figura 1A).</li>
		<li>Divida cada genótipo em quatro grupos 3 dias antes de realizar experimentos: ATR de luz ambiente -, ATR de luz ambiente +, ATR de luz vermelha ou azul - e ATR de luz vermelha ou azul +.</li>
		<li>Prepare a solução estoque de ATR 80 mM dissolvendo o ATR em etanol 100%. Suplementar os alimentos com 400 μM de ATR aos grupos ATR +.</li>
		<li>Suplementar o alimento com a mesma concentração de etanol mas sem ATR aos grupos ATR.</li>
		<li>Retaguarda todos os grupos no escuro22.</li>
		<li>Starve Gr5a&gt;CsChrimson voa por 16-24 horas em frascos contendo apenas tecido úmido. Os frascos ATR + contêm 400 μM ATR misturado com água, enquanto os frascos ATR - contêm dH2O misturado com a mesma concentração de etanol.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aspirador de moscas<ol>
		<li>Monte o aspirador de moscas (Figura 1B) usando tubos de plástico, rede contra insetos e duas pipetas de transferência de 3 mL.</li>
		<li>Corte as pontas e bulbos das pipetas de transferência, garantindo que a ponta de sucção da mosca permita a passagem confortável de uma mosca. Este design permite a aspiração suave das moscas por inalação, minimizando os danos e facilitando a coleta e transferência eficientes de moscas individuais.</li>
		<li>Coloque a rede contra insetos sobre o tubo de plástico e prenda as extremidades do bulbo da pipeta ao tubo usando Parafilm.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ensaio de preferência posicional termotático optogenética de luz azul de mosca única
<ol>
	<li>Cepas de Drosophila e criação de moscas<ol>
		<li>Cruze a linha de driver HC-Gal410 para UAS-GtACR23, resultando no genótipo experimental HC&gt;GtACR2. As moscas HC&gt;GtACR2 expressam GtACR2 em células de aquecimento. NOTA: Certifique-se de que um número igual de moscas machos e fêmeas seja usado para cada condição.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Configuração e execução do ensaio experimental<ol>
		<li>Alinhe duas placas de aço em placas quentes separadas para que suas bordas se encontrem. Coloque um protetor de folha de plástico por cima, prendendo-o com fita adesiva para minimizar o movimento. Posicione um pedaço de papel branco no protetor de folha para reduzir os sinais de ruído de fundo (Figura 1C). NOTA: Substitua o white paper no início de cada experimento ou quando estiver sujo.</li>
		<li>Coloque uma tampa de plástico transparente (2 mm de altura × 58 mm de largura × 83 mm de comprimento) em cima do papel branco. Esta capa permite que a mosca ande livremente, impedindo-a de voar.</li>
		<li>Faça um furo no fundo de uma caixa de espuma de poliestireno (27 cm de altura × 22 cm de largura × 16 cm de comprimento) para aderir à câmera e à luz azul (1.000 mA) aproximadamente 12 cm acima da superfície experimental.</li>
		<li>Posicione a câmera e a luz azul para minimizar o brilho enquanto ativa a ativação. NOTA: Um pré-teste pode ser necessário para determinar a faixa de ativação da luz azul.</li>
		<li>Configure a câmera para gravar com as seguintes configurações: lapso de tempo de 1 s, campo estreito, 4000 × 3000 pixels.</li>
		<li>Ajuste as configurações da placa de aquecimento para manter uma temperatura de superfície de 25 ± 1 °C e 31 ± 1 °C nas respectivas placas de aço. NOTA: Para condições que requerem temperaturas abaixo de 25 °C, são necessários métodos alternativos de resfriamento, como dispositivos Peltier ou gelo. Se as temperaturas das chapas de aço excederem os níveis desejados, borrife a superfície com água destilada para atingir e manter as condições necessárias. Em seguida, use um guardanapo para absorver o excesso de umidade do protetor de folha de plástico.</li>
		<li>Antes e depois de cada tentativa, monitore as temperaturas usando uma sonda de temperatura de superfície. NOTA: O controle preciso da temperatura é crucial, pois as flutuações podem afetar os resultados.</li>
		<li>Coloque a tampa plástica no lado de 25 °C. Usando um aspirador de moscas, solte suavemente uma única mosca sob a cobertura. Posicione a caixa acima da área experimental para criar luz fraca (&lt;10 lux) e permitir que a mosca se aclimate por 1 min.</li>
		<li>Após o período de aclimatação, levante a caixa e ajuste rapidamente a tampa plástica, posicionando-a com o centro da tampa alinhado com o limite da chapa de aço para garantir uma cobertura uniforme dos lados de 25 °C e 31 °C. NOTA: Durante este processo, a temperatura do ar e a temperatura dentro da tampa no lado de 31 °C aumentam para cerca de 27 °C em 5 s (Figura Suplementar 1), o suficiente para ativar as células de aquecimento11.</li>
		<li>Inicie o teste ligando a câmera e a luz azul (20 kLux). NOTA: Não acenda a luz azul em condições de luz ambiente. Ligue a câmera e grave alguns quadros antes de acender a luz azul em caso de movimento.</li>
		<li>Após mais de 2 minutos, termine o teste desligando a câmera e a luz. Descarte as moscas usando o aspirador. NOTA: Grave alguns quadros extras em caso de movimento ao desligar a câmera.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Análise comportamental e estatística<ol>
		<li>Analise apenas os dados das moscas que permanecem no lado de 25 °C no início do ensaio. NOTA: Rejeitar os dados das moscas que iniciam ensaios no lado de 31 °C, que apresentam frequentemente preferências alteradas23. Rejeitar os ensaios que envolvam moscas que não se aproximem do limite do lado de 31 °C, certificando-se de que escolheram entre as temperaturas. Descarte os dados das moscas que permanecem estacionárias por mais de 30 s.</li>
		<li>Analisar os resultados utilizando os procedimentos descritos anteriormente23. Calcule o índice de preferência (PI) como a razão entre a diferença de tempo que a mosca passou em cada zona de temperatura e o tempo total, conforme mostrado na seguinte fórmula: 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67964/67964eq01.jpg" style="margin: auto;"> NOTA: Os detalhes estatísticos dos experimentos são fornecidos nas legendas das figuras. A análise dos dados é realizada usando um software de análise de dados apropriado.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Ensaio de preferência posicional optogenética de luz vermelha de mosca única
<ol>
	<li>Cepas de Drosophila e criação de moscas<ol>
		<li>Cruze a linha de driver Gr66a-Gal421 para UAS-CsChrimson2, resultando no genótipo experimental Gr66a&gt;CsChrimson. As moscas Gr66a&gt;CsChrimson expressam CsChrimson em neurônios de sabor amargo. NOTA: Certifique-se de que um número igual de moscas machos e fêmeas seja usado para cada condição.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Configuração e execução do ensaio experimental<ol>
		<li>Conduza o ensaio em uma sala escura ou ambiente escuro para garantir a ativação controlada de CsChrimson ( Figura 1D ).</li>
		<li>Posicione uma câmara de vídeo cerca de 45 cm acima da superfície experimental.<ol>
			<li>Use uma câmera de vídeo sem filtro infravermelho. Se uma câmara de vídeo tiver um filtro infravermelho passa-curto interno que bloqueia comprimentos de onda superiores a 700 nm, remova-o.</li>
			<li>Cole um filtro passa-longo de 830 nm sobre a lente usando super cola para capturar os comprimentos de onda infravermelhos. Este ajuste é essencial para registrar o movimento da mosca sob condições de luz infravermelha.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Posicione uma fonte de luz vermelha24 aproximadamente 45 cm acima da superfície experimental, garantindo uma intensidade de luz de cerca de 2.5 kLux (1,000 mA). NOTA: Recomenda-se proteção ocular adequada que possa filtrar o laser/luz vermelha. Os óculos de segurança a laser ajudam a prevenir possíveis danos aos olhos devido à exposição direta à luz vermelha intensa.</li>
		<li>Use uma luz infravermelha para visualizar as moscas dentro da configuração. Mantenha-o ligado durante todo o experimento. NOTA: Evite o brilho na área experimental causado pela luz infravermelha; O brilho pode complicar a análise de dados.</li>
		<li>Use cola para prender um filtro infravermelho passa-longo de 780 nm na metade da tampa plástica. NOTA: Use qualquer filtro passa-longo que bloqueie comprimentos de onda abaixo de 780 nm. O lado não filtrado permite a passagem da luz vermelha e do infravermelho, enquanto o lado filtrado permite apenas a passagem da luz infravermelha.</li>
		<li>Coloque um material preto fosco embaixo da área experimental para minimizar o ruído de fundo.</li>
		<li>Coloque uma única mosca sob uma cobertura de plástico transparente (2 mm de altura × 58 mm de largura × 83 mm de comprimento) usando um aspirador de moscas e deixe-a aclimatar por 1 min.</li>
		<li>Aguarde até que a mosca esteja visível no lado não filtrado. Inicie o teste ligando a câmera de vídeo e a luz vermelha. NOTA: A câmara de vídeo é suscetível a movimentos imediatamente após o arranque. Prenda bem a câmera durante a gravação e ligue-a vários segundos antes de gravar para evitar movimentos aberrantes que podem complicar a análise. Não acenda a luz vermelha até o início do teste.</li>
		<li>Registre o movimento da mosca por 1 min. NOTA: Descarte as tentativas em que a mosca não se aproxima da linha média ou não se move por mais de 15 s.</li>
		<li>Após 1 min, termine o teste desligando a câmara de vídeo e a luz. Descarte as moscas usando o aspirador. NOTA: Grave alguns quadros extras para evitar os efeitos do movimento ao desligar a câmera.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Análise comportamental e estatística<ol>
		<li>Analisar os resultados utilizando os procedimentos descritos anteriormente23. Calcule o índice de preferência (PI) como a razão entre a diferença entre o tempo que a mosca passou na área sem o filtro e a área com o filtro e o tempo total, conforme mostrado na fórmula a seguir: 
		<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67964/67964eq02.jpg" style="margin: auto;"> NOTA: Os detalhes estatísticos dos experimentos são fornecidos nas legendas das figuras. A análise dos dados é realizada usando um software de análise de dados apropriado.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Resposta de extensão de probóscide optogenética de luz vermelha
<ol>
	<li>Cepas de Drosophila e criação de moscas<ol>
		<li>Cruze a linha de driver Gr5a-Gal420 para UAS-CsChrimson2, resultando no genótipo experimental conhecido como Gr5a&gt;CsChrimson. As moscas Gr5a&gt;CsChrimson expressam CsChrimson em neurônios receptores de sabor doce. NOTA: Certifique-se de que um número igual de moscas machos e fêmeas seja usado para cada condição.</li>
		<li>Voos de fome por 16-24 h com ATR (ATR +) ou sem (ATR -) antes do teste. NOTA: Períodos de fome mais longos podem ser necessários para obter uma resposta forte.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Configuração e execução do ensaio experimental<ol>
		<li>Anestesiar moscas resfriando no gelo (Figura 1E). NOTA: Evite o contato direto entre moscas e gelo. Limite o tempo de resfriamento a cerca de 1 min; O resfriamento prolongado pode resultar em problemas de recuperação e mortalidade.</li>
		<li>Use a ponta de uma ponta de pipeta de 1000 μL para aplicar 7 a 10 pequenos pontos de cola nas lâminas de vidro. NOTA: Pequenas gotas de cola no slide garantem que a mosca não fique submersa e ajudam a evitar que a cola grude em sua tromba ou pernas.</li>
		<li>Posicione uma mosca, com o lado ventral para cima, em cada ponto de cola. Certifique-se de que o tórax e as asas entrem em contato com a cola para minimizar o movimento. Espalhe as asas para cada lado para aumentar a área da superfície adesiva. NOTA: Evite colocar moscas muito próximas umas das outras, o que pode ativar inadvertidamente várias moscas durante a exposição à luz.</li>
		<li>Deixe a cola secar por cerca de 10 min.</li>
		<li>Transfira as lâminas para uma caixa de umidade (uma caixa de plástico com toalhas de papel molhadas) e deixe as moscas se recuperarem por 2 h.</li>
		<li>Coloque a lâmina sob o microscópio. Use uma seringa para fornecer uma gota de água para saciar as moscas, evitando extensões de tromba induzidas pela sede.</li>
		<li>Segure manualmente um ponteiro laser vermelho para acender a luz vermelha na tromba/cabeça de uma única mosca (700 lux) enquanto observa a resposta PER através do microscópio. NOTA: A proteção para os olhos que pode filtrar o laser/luz vermelha é essencial ao observar a luz vermelha através do microscópio.</li>
		<li>Observe e registre a extensão da tromba dentro de uma janela de 30 segundos. Marque cada mosca usando o seguinte sistema de registro: 0 indica nenhuma extensão, 0,5 indica extensão de 1-2 s, 1 indica que a extensão dura mais de 3 s.</li>
		<li>Depois de testar a extensão da tromba induzida por luz, examine a resposta à sacarose a 4% usando uma seringa. Expulse uma gota de sacarose na ponta da agulha e aproxime-a da tromba da mosca. NOTA: Descarte os dados das moscas que não respondem à gota de sacarose.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Análise comportamental e estatística<ol>
		<li>Realize análises estatísticas usando um software de análise de dados apropriado. NOTA: Os detalhes estatísticos dos experimentos são fornecidos nas legendas das figuras.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Ensaio optogenético do labirinto da mosca da Vermelho-luz
<ol>
	<li>Cepas de Drosophila e criação de moscas<ol>
		<li>Cruze a linha de driver Gr66a-Gal421 para UAS-CsChrimson2, resultando no genótipo experimental Gr66a&gt;CsChrimson. As moscas Gr66a&gt;CsChrimson expressam CsChrimson em neurônios de sabor amargo. NOTA: Certifique-se de que cada grupo contenha um número igual de moscas machos e fêmeas.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Montagem do labirinto de moscas<ol>
		<li>Faça o labirinto de moscas conforme mostrado na Figura 1F. NOTA: Como alternativa, imprima em 3D os componentes do labirinto de moscas, montando conforme detalhado anteriormente25.</li>
		<li>Corte três tubos de cultura de plástico de 5 mL em comprimentos adequados para fazer um tubo de carregamento, um tubo de teste transparente descoberto e um tubo de ensaio coberto com papel alumínio. Prenda os tubos ao labirinto de moscas conforme mostrado na Figura 1F.<ol>
			<li>Dependendo do material do labirinto, corte os tubos de ensaio para garantir uma distância igual para cada condição de teste. Com base no comprimento da câmara de retenção, encurte o tubo de ensaio descoberto em um labirinto transparente, enquanto encurta o tubo de teste coberto de folha metálica se o labirinto for opaco.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Configuração e execução do ensaio experimental<ol>
		<li>Em condições de pouca luz, coloque 10 machos e 10 fêmeas no tubo de carregamento. Conecte o tubo de carregamento à câmara de retenção. Incline o elevador e bata suavemente no tubo para mover as moscas para a câmara de retenção. NOTA: Abaixe o elevador de forma que apenas metade da câmara de retenção fique aberta. Essa manipulação facilita a transferência de moscas do tubo de carregamento para a câmara de retenção.</li>
		<li>Depois que as moscas forem transferidas para a câmara de retenção, use o elevador para abaixar as moscas entre o tubo de carregamento e os orifícios do tubo de teste. Em seguida, remova o tubo de carregamento.</li>
		<li>Posicione o labirinto de moscas a aproximadamente 13 cm de distância da fonte de luz vermelha (1000 mA) sem acender a luz.</li>
		<li>Abaixe o elevador até que a câmara de retenção se alinhe com os orifícios do tubo de teste, permitindo que as moscas se movam livremente entre os tubos de ensaio envoltos em papel alumínio e os descobertos. Simultaneamente, acenda a luz vermelha para ativar o CsChrimson. Certifique-se de que a intensidade da luz vermelha na superfície do tubo de ensaio descoberto seja de cerca de 40 kLux. NOTA: Não acenda a luz vermelha até que a câmara de retenção esteja abaixada e alinhada com os orifícios do tubo de teste. Recomenda-se proteção ocular adequada que possa filtrar o laser/luz vermelha devido ao intenso brilho da luz vermelha.</li>
		<li>As moscas escolhem entre o tubo exposto à luz vermelha e o tubo sombreado por um minuto.</li>
		<li>Após 1 min, levante o elevador entre o tubo de carregamento e os orifícios do tubo de teste. Conte as moscas em cada tubo. NOTA: Apenas moscas ativas e não feridas são contadas.</li>
		<li>Limpe o elevador e o labirinto usando dH2O após cada tentativa.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Análise de dados e estatística<ol>
		<li>Calcule o índice de preferência (PI) como a razão entre a diferença no número de moscas entre tubos descobertos e cobertos e o número total de moscas, conforme mostrado na fórmula a seguir: 
		<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/67964/67964eq03.jpg" style="margin: auto;"> NOTA: Os detalhes estatísticos dos experimentos são fornecidos nas legendas das figuras. A análise de dados é realizada usando um software de análise de dados apropriado</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Chyb, S., Dahanukar, A., Wickens, A., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+gr5a+encodes+a+taste+receptor+tuned+to+trehalose%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Drosophila gr5a encodes a taste receptor tuned to trehalose.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (Suppl 2), 14526-14530 (2003).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>Driver LED de 1000 mA</td><td>Luxeon Star</td><td>3021-D-E-1000</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de Cultura VWR de 5 mL, Plástico, com Tampas de Posição Dupla</td><td>VWR</td><td>60818-664</td><td></td></tr><tr><td>780 Filtro Longpass / IR 780 nm 100 mm x 100 mm</td><td>Lee Filters</td><td>BH #LE8744</td><td>Cortado para aproximadamente 47 x 100 se encaixa na tampa de plástico</td></tr><tr><td>Rede de Jardim Agfabric 6.5 ft. x 15 ft. Rede de Insetos para Proteção de Plantas Vegetais Flores Frutas</td><td>The Home Depot</td><td>EIBNW6515</td><td></td></tr> Placa de Alumínio <tr><td>Trans Sigma-Aldrich</td><td>116-31-4</td><td></td><td>totalmente trans-retiniana</td></tr><tr><td>(30,5 cm x 30,5 cm x 0,6 cm)</td> <td>Amazon</td><td></td><td>comprada da Amazon</td></tr><tr><td>Caixa de Plástico Preto</td><td>LI-COR</td><td>929-97101</td><td></td></tr><tr><td>CLORETO DE CÁLCIO ANIDRO 25GR</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>AC297150250</tr><tr><td>CX405 Handycam com sensor CMOS EXMOR R</td><td>SONY</td><td>HDR-CX405</td><td></td></tr><tr><td>Elmer' s &ldquo; Cola escolar"</td>Álcool etílico <td>Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, Puro (200 Proof)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Isotemp Hot Plate Stirrer</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP88850200</td><td></td></tr><tr><td>Linha de mosca: Gr5a-Gal4</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>57592</td><td></td></tr><tr><td>Linha de mosca: Gr66a-Gal4</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>57670</td><td></td></tr><tr><td>Linha de mosca: HC-Gal4 (II)</td><td>Dr. Marco Gallio Lab</td><td></td><td>Um presente gentil</td></tr><tr><td>Linha de mosca: UAS-CsChrimson</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>55136</td><td></td></tr><tr><td>Linha de mosca: UAS-GtACR2/TM6B</td><td>Dr. Quentin Gaudry Lab</td><td></td><td>Um presente gentil</td></tr><tr><td>Flystuff 62-101 Fubá Amarelo (11,3 Kg), Amarelo, 11,3 Kg/Unidade</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-101</td><td></td></tr><tr><td>Levedura Seca Inativa Flystuff 62-107, 10 Kg, Flocos Nutricionais, 10 Kg/Unidade</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-107</td><td></td></tr><tr><td>Flystuff 66-103 Nutri-Fly Drosophila Agar, Gelidium, 100 Mesh, 5 Kg (11.02 lbs)/Unidade</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-103</td><td></td></tr><tr><td>Grátis Mascote OD 8+ 190 nm&ndash; 420 nm / 600 nm&ndash; Óculos de Segurança Laser Violeta/Vermelho/Infravermelho de Comprimento de Onda de 1100 nm&nbsp;</td><td>Mascote grátis&nbsp;</td><td>B08LGMQ65S</td><td>comprado na Amazon</td></tr><tr><td>GoPro Hero8 Black</td><td>GoPro</td><td>6365359</td><td></td></tr><tr><td>LEE Filters 100&vezes; 100 mm Infravermelho Vermelho # 87 Filtro de Poliéster Infravermelho</td><td>B & H Photo</td><td>LE8744</td><td></td></tr><tr><td>Filtro Longpass, Vidro Colorido, 50.8 x 50.8 mm, 830 nm Cut-on, RG830</td><td>Newport</td><td>FSQ-RG830</td><td></td></tr><tr><td>Metil 4-hidroxibenzoato, 99%, Thermo Scientific Chemicals</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>126960025</tr><tr><td>MicroWell Mini Bandeja 60 Poços, Perfil Baixo NS PS</td><td>Thermal Scientific&nbsp;</td><td>NUNC 439225</td><td>As tampas são usadas como a "tampa de plástico"</td></tr> <tr><td>Olympus Plastics 24-160RS, 1000 &micro; L Pontas de Pipeta Ergonômicas Olympus de Baixa Encadernação, Racked, Estéril, 8 Racks de 96 Pontas/Unidade</td><td>Filme de Vedação Eppendorf</td><td>24-160RS</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Heathrow Scientific</td><td>HS234526B</td><td>4 in x 125 pés</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio, ACS, 99.0-100.5%,&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>AA1159530</tr><tr><td>Software de análise de dados</td><td>Prism</td><td>GraphPad</td><td>Versão 9</td></tr><tr><td>Pipetas de Transferência Graduada Samco</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>225</td> Slides <td>de 3 mL</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-2</td><td>&nbsp; Microscópio estéreo de 5 mm x 75 mm x 1,0 mm</td></tr> Caixa de isopor <tr><td></td><td>OLYMPUS</td><td>CZ61</td><td></td></tr><tr><td>(27 cm de altura e tempos; 22 cm de largura e tempos; 16 cm de comprimento)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Sacarose</td><td>Fisher Scientific</td><td>225911</td><td></td></tr><tr><td>Sonda de temperatura de superfície</td><td>Seringa Fluke</td><td>80PK-3A</td><td></td></tr><tr><td>BD</td><td>Integra</td><td>305270</td><td></td></tr><tr><td>Tate & Lyle 457 Dextrose, Tate & amp Lyle, Pow, Tate & Lyle 457 Dextrose, Tate & amp Lyle, Pó, 50 lbs/Unidade</td> Termômetro de Termopar de Dígitos Grandes Calibrado <td>Rastreável Genesee Scientific</td><td>62-113</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Rastreável por cple-parmer</td><td>&nbsp; UX-91210-07</td><td>Termômetro Fisherbrand Rastreável BigDigit Tipo K</td></tr><tr><td>LED LED azul triplo LED de estibordoFornecido</td><td></td><td>07007-PB000-D</td><td>470 nm</td></tr><tr><td>LED vermelho triplo LED de estibordoFornecido</td><td></td><td>07007-PD000-F</td><td>627 nm</td></tr><tr><td>Tubo de PVC Tygon Transparente 1/4" ID, 3/8" OD, 5 pés. Comprimento&nbsp;</td><td>McMaster Carr Supply Company&nbsp;</td><td>6516T21&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Iluminador IR Univivi, 850nm 12 LEDs Iluminador IR Grande Angular para Visão Noturna</td><td>Univivi</td><td>4331910725</td><td></td></tr><tr><td>Wakefield Thermal 25.4 mm Round Heatsink Star LED Board - 882-100AB</td><td>Wakefield-Vette</td><td>882-100AB</td><td></td></tr><tr><td>Apresentador sem fio</td><td>DinoFire Store</td><td>B01410YNAM</td><td>comprado na Amazon</td></tr></tbody></table>

ensaios comportamentais para manipulação optogenética de circuitos neurais em drosophila melanogaster

Behavioral Assays for Optogenetic Manipulation of Neural Circuits in Drosophila melanogaster

Ensaio de preferência posicional termotático optogenética de luz azul de mosca única Quatro condições foram testadas: luz ambiente sem suplementação de ATR (luz ambiente, ATR -), luz ambiente com suplementação ATR (luz ambiente, ATR +), luz azul sem suplementação ATR (azul, ATR -) e luz azul com suplementação ATR (azul, ATR +). As três primeiras condições serviram como controles. Em experimentos de controle, as moscas evitaram o lado de 31 ° C. Na luz azul com suplementação de ATR, as moscas não exibi...

Ensaios Comportamentais para Manipulação Optogenética de Circuitos Neurais em Drosophila melanogaster

Optogenetics has become a fundamental technique in neuroscience, enabling precise control of neuronal activity through light stimulation. This study ...

behavioral-assays-for-optogenetic-manipulation-neural-circuits

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

A optogenética permite o uso da luz para manipular neurônios que são geneticamente modificados para expressar opsinas específicas – proteínas sensíveis à luz cuja ativação da luz desencadeia uma mudança no estado do neurônio. Aqui descrevemos uma abordagem optogenética em Drosophila usando a opsina Channelrhodopsin2. O protocolo de exemplo apresenta um conjunto de ensaios optogenéticos para estudar os circuitos neuronais por trás do comportamento de fuga da mosca.

drosófila Optogenética: um método para manipular circuitos neuronais

Este vídeo demonstra um estudo do comportamento de navegação de larvas de Drosophila em resposta à estimulação optogenética de neurônios sensoriais olfativos (ORNs). As larvas transgênicas de Drosophila que expressam canais iônicos sensíveis à luz nos ORNs são colocadas em agarose dentro de uma arena comportamental. A estimulação optogenética com luz abre os canais, causando um influxo de cátions que desencadeia a transmissão do sinal para o cérebro, e o comportamento de navegação é registrado.

Comportamento de navegação de larvas de Drosophila em resposta à estimulação optogenética de neurônios sensoriais olfativos

Ferramentas optogenética codificados geneticamente permitir a manipulação não invasiva de neurónios específicos...

Optogenética estimulação do comportamento de fuga em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aqui nós descrevemos um teste de preferência claro-escuro para Drosophila larva. Este ensaio fornece informações sobre regulação inata e circadiano da luz de sensoriamento e processamento photobehavior.

Luz Ensaio Preferências para estudar inata e circadiano Photobehavior Regulamentado<em&gt; Drosophila</em&gt; As larvas

Aqui nós descrevemos um protocolo para manipulação optogenetic de atividade motoneurônio enquanto monitora mudanças na saída do motor (contração muscular) em...

Optogenetic Perturbação da atividade neural com Iluminação Laser no Semi-intacta<em&gt; Drosophila</em&gt; As larvas in Motion

Neste artigo de vídeo, descrevemos um método automatizado para medir o efeito de fome ou saciedade em olfativo comportamento de busca de alimentos dependente na fruta Drosophila melanogaster mosca adulta.

A Single-fly Ensaio para comportamento de forrageamento em Drosophila

Descrevemos aqui uma configuração comportamental e método de análise de dados para testar as respostas olfativas de até 100 moscas do vinagre (Drosophila melanogaster). Este sistema pode ser usado com estímulos olfativos únicos ou múltiplos e adaptável para ativação optogenética ou silenciamento de subconjuntos neuronais.

Comportamentos olfativos ensaiadas pelo monitoramento do computador de<em&gt; Drosophila</em&gt; Em um olfatômetro de quatro quadrantes

Este protocolo analisa comportamento de navegação de larvas de Drosophila em resposta à estimulação optogenetic simultânea de seus neurônios olfativos. Luz de comprimento de onda de 630 nm é usada para ativar individuais neurônios olfativos expressando uma rodopsina canal avermelhado. Larval movimento simultaneamente é controlado digitalmente gravado e analisados utilizando o software personalizados.

Rastreamento do comportamento larval de Drosophila em resposta à estimulação optogenética de neurônios olfativos

Este protocolo introduz um ensaio do luz-ponto para investigar o comportamento phototática da Drosophila larval. Neste ensaio, um ponto luminoso é gerado como a estimulação clara, e o processo da vacância clara larval é gravado por um sistema Light-based infravermelho da imagem latente.

Ensaio Light Spot-Based para análise de Drosophila larval Phototaxis

O presente protocolo descreve a geração de Drosophila melanogaster expressando opsinas eNpHR2.0 ou ReaChR no coração para imagem OCT e ritmo cardíaco optogenético. Instruções detalhadas para imagem de Drosophila OCT e modulação de batimentos cardíacos, incluindo a simulação de parada cardíaca restauradora, bradicardia e taquicardia em animais vivos em diferentes estágios de desenvolvimento, são relatadas.

Desenvolvendo Modelos de Melanogaster Drosophila para Imagem e Controle Optogenético da Função Cardíaca

O protocolo apresenta um método de alto rendimento e custo-benefício para avaliar a neurotoxicidade na mosca-da-fruta por meio da quantificação da disfunção locomotora como alternativa aos modelos tradicionais de mamíferos. Tem como objetivo avaliar os efeitos neurotóxicos de compostos farmacêuticos, agentes ambientais ou modificações genéticas usando um modelo sensível, reprodutível e eticamente favorável.

Análise comportamental da disfunção locomotora em Drosophila melanogaster como leitura de neurotoxicidade

Aprenda ensaios comportamentais para manipulação optogenética de circuitos neurais em Drosophila melanogaster. Este método utiliza CsChrimson e GtACR2 para estudar comportamentos termotáticos e gustativos com precisão.

Ensaios Comportamentais para Manipulação Optogenética de Circuitos Neurais em Drosophila melanogaster

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