Name: Um modelo de bexiga in vitro de infecção do trato urinário associada a cateter (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Aprenda a usar um modelo de bexiga in vitro para estudar infecções do trato urinário associadas a cateter e avaliar tratamentos antimicrobianos contra biofilmes bacterianos.

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<table><tbody><tr><td>Extensão de Cabeçote de Carga Rápida 313</td><td>Watson-Marlow</td><td>313</td><td>Bomba peristáltica - extensão extra do cabeçote&nbsp;</td></tr><tr><td>Bomba de controle manual de velocidade variável 323S/D</td><td>Watson-Marlow</td><td>323S/D</td><td>Bomba peristáltica</td></tr><tr><td>3L Sacos de cama, estéreis com torneiras de alavanca&nbsp;</td><td>Great Bear Healthcare&nbsp;</td><td>GDW173</td><td></td></tr><tr><td>Tubulação de silicone curada com platina de 3 mm de diâmetro interno</td> Tubulação de circuito AUM pequeno <td>Fisher</td><td>10111801</td><td>(conecte a tubulação da bomba aos modelos)</td></tr> <tr><td>Tubulação de silicone curada com platina de diâmetro interno de 5 mm</td> Tubulação de circuito AUM médio <td>Fisher</td><td>10539201</td><td>(conecte a tubulação da bomba ao reservatório AUM)</td></tr> <tr><td>cloreto de amônio (NH4Cl)</td><td>Fisher</td><td>11473713</td><td></td></tr><tr><td>sulfato de sódio anidro (Na2SO4)</td>Conector cônico <td>Fisher</td><td>11498717</td><td></td></tr><tr><td>Azlon&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>10712807</td><td>Usado para conectar diferentes comprimentos de tubulação no circuito AUM</td></tr><tr><td>Cabides de saco de cama&nbsp;</td><td>Great Bear Healthcare&nbsp;</td><td>10705P</td><td></td></tr><tr><td>Braçadeiras de tubo de torneira de aperto Bochem, diâmetro de 25 mm</td><td>Cloreto de cálcio 11805101</td><td></td><td>Fisher</td></tr><tr><td>(CaCl2)</td><td>Ácido</td> cítrico <td>monohidratado 10021681</td><td></td>Fisher</tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Merck</td><td>C1909-500G</td><td>Usado para remover biofilme cristalino de modelos pós-experimentação&nbsp;</td></tr><tr><td>Marca Fisher&nbsp; Pipetas de vidro graduadas Classe B Tipo 1</td><td>Fisher</td><td>11992168</td><td>Usado para fornecer modelos de blader in vitro com AUM via gelatina de rolha perfurada</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>24360.233</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad prism 10</td><td>GraphPad</td><td>V10.0</td><td>Software analítico usado para representar graficamente os resultados do modelo de bexiga in vitro e análise estatística.&nbsp;</td></tr><tr><td>Medidor de pH de bancada Hanna HI 2211-02</td><td>Phillip Harris&nbsp;</td><td>PP00057414</td><td></td></tr><tr><td>Modelo in vitro bexiga&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td>Equipamento sob medida, conforme descrito anteriormente por Nzakizwanayo et al. (2019).</td></tr><tr><td>Instillagel 6 mL gel lubrificante</td><td>mydoctorshop.co.uk</td><td>40-006</td><td>Géis lubrificantes utilizados no ponto 7.1.; outros fornecedores estão disponíveis.</td></tr><tr><td>Conector cônico irregular Kartell Plastilab</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>11914289</td><td>Usado para conectar tubos de diferentes diâmetros</td></tr><tr><td>Ágar MacConkey sem sal (desidratado)</td><td>Fisher</td><td>10472643</td><td>Para a enumeração de colônias únicas de bactérias em enxame, ou seja, Proteus mirabilis</td></tr><tr><td>cloreto de magnésio hexahidratado (MgCl2.6H2O)</td><td>Fisher</td><td>10386743</td><td></td></tr><tr><td>fosfato monopotássico (KH2PO4)</td><td>Conector</td><td></td> em forma de Y Fisher 10573181 <td></td></tr><tr><td>Nalgene</td><td>Fisher</td><td>10186070</td><td>Usado para executar vários circuitos AUM a partir de um reservatório AUM (1-4 modelos por tanque)&nbsp;</td></tr><tr><td>cloreto de potássio (KCl)</td><td>Fisher</td><td>10375810</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex Frasco Aspirador com Soquete Lateral de Vidro Moído, Capacidade: 5000 mL</td><td>Reservatório Fisher</td><td>11347884</td><td>AUM</td></tr><tr><td>Rolhas de borracha com furo, Diâmetro externo: 37mm, Vermelho, Diâmetro: 37mm</td><td>Fisher</td><td>11517612</td><td>Usado em reservatório AUM e para fornecer modelos in vitro com AUM</td></tr><tr><td>Tamanho 14 Cateter Foley de silicone francês 100% com seringa estéril de água para inflação&nbsp;</td><td>Great Bear Healthcare&nbsp;</td><td>4833-0514</td><td></td></tr><tr><td>cloreto de sódio (NaCl)</td><td>Fisher</td><td>10735921</td><td></td></tr><tr><td>oxalato de sódio (Na2C2O4)</td><td>Fisher</td><td>10442211</td><td></td></tr><tr><td>Teknon Biocleanse concentrado limpador biocida 5L&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>12447580</td><td>Usado para esterilizar modelos pós-experimentação</td></tr><tr><td>citrato trissódico (Na3C6H5O7)</td><td>Fisher</td><td>11434993</td><td></td></tr><tr><td>triptona caldo de soja</td><td>Fisher</td><td>10198002</td><td></td></tr><tr><td>uréia (CH4N2O)</td><td>Fisher</td><td>10404185</td><td></td></tr><tr><td>Uro-Tainer M NaCl 0,9%</td><td>B.Braun</td><td>FB99833</td><td>Bolsa de irrigação de bexiga salina usada na seção 7.2.&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubo de silicone curado com platina de diâmetro interno Watson-Marlow Pumpsil de 1,6 mm</td><td>Fisher</td><td>12406280</td><td>Tubo de circuito AUM espesso (para uso em bomba perstálgica)</td></tr></tbody></table>

um modelo de bexiga in vitro de infecção do trato urinário associada a cateter

An In Vitro Bladder Model of Catheter-Associated Urinary Tract Infection

A operação bem-sucedida do modelo de bexiga in vitro depende da prática de uma boa técnica asséptica e da observação cuidadosa da turbidez do meio durante a experimentação (Figura 3). Antes da inoculação, o AUM estéril era de cor amarelo pálido e transparente na câmara central do modelo de bexiga in vitro (Figura 3A). O AUM no reservatório do meio deve permanecer claro durante toda a experimentação, pois quaisquer alterações de turbidez que ocorram podem indicar precipitação de sais da solução ou contaminação do meio. Se o AUM no reservatório de mídia ou na tubulação do circuito de mídia ficar turvo ou mostrar uma mudança drástica na cor, as réplicas devem ser descartadas e repetidas. Após a inoculação, um aumento na turbidez do AUM na câmara central do modelo de bexiga in vitro é claramente visível ( Figura 3B ). Mudanças na turbidez são frequentemente mais pronunciadas em organismos positivos para urease, como P. mirabilis, mas ainda devem ser visíveis após a inoculação em organismos negativos para urease. Após o início do fluxo de AUM, uma redução na turbidez do AUM é frequentemente observada à medida que as células planctônicas são eliminadas e não indica falta de células viáveis no modelo. A observação do nível do meio na câmara central também pode ser usada para determinar o tempo de bloqueio se forem utilizados organismos positivos para urease (Figura 3C). À medida que os modelos estão funcionando, o orifício e a ponta do cateter devem estar completamente visíveis para indicar a drenagem adequada para os sacos de lixo. Após o bloqueio, o nível de AUM na câmara central subirá acima dos orifícios e da ponta do cateter, indicando que o experimento está pronto para qualquer leitura e término do ponto final. Durante a experimentação, os efeitos da pressão no circuito de mídia do modelo da bexiga in vitro podem fazer com que os modelos pareçam bloqueados. Se houver suspeita de bloqueio, verifique se o circuito AUM, o cateter e a tubulação do saco de resíduos estão esticados antes de encerrar o ensaio, pois quaisquer bolhas de ar ou dobras potenciais na tubulação podem causar "eclusas de ar" e impedir a drenagem do cateter.
Durante experimentos de modelo de bexiga in vitro , a amostragem planctônica pode fornecer informações valiosas sobre a dinâmica de crescimento dentro do modelo, bem como a progressão do CAUTI. O crescimento celular, o pH e a formação de biofilme podem ser monitorados durante a experimentação sem a necessidade de encerrar os modelos (Figura 4). Se estiver usando organismos positivos para urease, os cálculos do tempo de bloqueio podem ser utilizados como uma medida da taxa de formação de biofilme e usados para comparar as propriedades de diferentes cepas bacterianas (Figura 4). A comparação de uma cepa de tipo selvagem de P. mirabilis e um mutante LPS (mini-tn5 inserção em waaC) demonstrou uma extensão do tempo de bloqueio e, portanto, reduziu a formação de biofilme no mutante (Figura 4). Organismos negativos para urease normalmente não bloqueiam modelos de bexiga in vitro e, portanto, recomenda-se que um ponto final definido seja determinado antes da experimentação. Em alguns casos, organismos negativos para urease podem resultar em bloqueio do cateter. Por exemplo, cepas negativas de urease de Klebsiella pneumoniae podem produzir biofilmes mucoides extensos, no entanto, eles geralmente levam muito mais tempo do que os biofilmes positivos para urease para bloquear a drenagem, portanto, um ponto final definido ainda é recomendado.
A medição do pH durante a experimentação do modelo da bexiga também pode fornecer informações sobre as diferenças entre cepas, bem como o progresso do CAUTI. Se forem utilizados organismos negativos para urease, o pH na câmara central do modelo de bexiga in vitro deve permanecer estável durante a experimentação, embora pequenas flutuações no pH sejam esperadas à medida que a dinâmica populacional muda ao longo do experimento. A inoculação de modelos in vitro com organismos positivos para urease resulta em um aumento significativo do pH ao longo do tempo, com o pH mais alto geralmente sendo observado no momento do bloqueio, onde leituras de pH tão altas quanto ~ 8-9 podem ser observadas ( Figura 4B ).
A enumeração de UFC/mL planctônica é um componente importante da modelagem da bexiga in vitro , permitindo que os operadores avaliem se a inoculação foi bem-sucedida e monitorem o progresso da experimentação. A medição de UFC/mL no final da experimentação pode destacar quaisquer diferenças na colonização da bexiga entre diferentes cepas bacterianas. Ao comparar a cepa mutante mini-Tn5 de P. mirabilis com a selvagem, foi observada uma redução significativa na UFC/mL no momento do bloqueio (Figura 4C). Além disso, a enumeração de UFC de biofilmes na superfície do cateter e a quantificação da biomassa do biofilme podem fornecer informações sobre a capacidade de diferentes patógenos de colonizar o trato urinário cateterizado. Corantes de cristal violeta foram usados para determinar diferenças na formação de biofilme entre uma cepa de P. mirabilis de tipo selvagem HI4320 e isolados passados em clorexidina (Figura 5). Medições de densidade óptica a 595 nm demonstraram que os isolados passados na clorexidina exibiram uma redução na formação de biofilme em comparação com os selvagens e controles passados na ausência de clorexidina.
Como o objetivo do modelo de bexiga in vitro é replicar com precisão o nicho CAUTI, os modelos também podem ser utilizados para estudar os efeitos da terapêutica antimicrobiana destinada a tratar CAUTI em um ambiente clinicamente relevante. Para organismos positivos para urease, comparar os tempos de bloqueio de modelos tratados com modelos não tratados pode fornecer informações úteis sobre a eficácia do tratamento. O tratamento de modelos de bexiga in vitro inoculados com P. mirabilis com uma solução de irrigação de bexiga com clorexidina a 0,02% estendeu significativamente o tempo de bloqueio em comparação com modelos que não foram tratados ou tratados com solução salina a 0,9% (Figura 6A). Além disso, o modelo de bexiga in vitro pode ser utilizado para estudar a atividade bactericida de terapêuticas antimicrobianas. O monitoramento de alterações na UFC/mL de células planctônicas e associadas ao biofilme após o tratamento antimicrobiano pode indicar se os tratamentos são eficazes. O tratamento de modelos de bexiga in vitro inoculados com P. mirabilis demonstrou uma redução de &gt;7 log na UFC/mL planctônica imediatamente após o tratamento, em comparação com modelos não tratados e irrigados com solução salina a 0,9% quando aplicados de acordo com as instruções do fabricante (Figura 6B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67966/67966fig01.jpg"> 
Figura 1: Esquema dos principais componentes do modelo de bexiga in vitro . (A) O modelo de bexiga (sistema de drenagem fechado): (1) câmara de vidro de parede dupla simulando a bexiga (2) entrada de meio, AU é fornecida via bomba peristáltica para a câmara interna do modelo de bexiga (3) entrada de água fornecida via banho-maria circulante para a câmara externa (4) saída de água (5) cateter de Foley, inserido na câmara interna (6) ponto de conexão do lúmen de drenagem; ponto de conexão para saco de lixo/bolsas de irrigação (7) saco de drenagem coletando o fluxo de urina. (B) Esquema que descreve a configuração do modelo de bexiga in vitro e a direção do fluxo de meio e água através do modelo. A urina artificial é armazenada em um reservatório de mídia (1) à temperatura ambiente e fornecida ao modelo por meio de uma bomba peristáltica (2) a uma taxa de fluxo constante de ~ 0,75 mL min-1 durante o experimento. O meio flui para a câmara central do vaso de vidro de parede dupla que representa a bexiga (3) e drena através do orifício do olho de um cateter de Foley (4) para uma bolsa de drenagem (5), completando o sistema de drenagem fechado estéril. O modelo de bexiga in vitro é mantido a uma temperatura constante de 37 °C através de um banho-maria circulante (6), que flui através da câmara exterior do recipiente de vidro de parede dupla. As linhas tracejadas representam tubos de silicone e as setas representam a direção do fluxo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67966/67966fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67966/67966fig02.jpg"> 
Figura 2: Secção de cateteres urinários para processar células associadas ao biofilme. Pontos de exemplo em um cateter urinário para dissecção para quantificação de biofilme a jusante. (A) Os cateteres são primeiro seccionados latitudinalmente na região de 8 cm proximal à ponta/orifícios oculares (onde se observa a maior parte da formação de biofilme). Cortes de 1 cm são removidos com bisturi, geralmente evitando a região que contém o balão do cateter desinsuflado devido às dificuldades de reprodutibilidade do processamento (1-3). (B) Uma vez que os cateteres são inicialmente seccionados em pedaços de 1 cm, outro corte longitudinal é feito no lúmen central para expor qualquer biofilme presente para posterior quantificação do biofilme, ou seja, enumeração de UFC / mL de coloração violeta de cristal. As linhas tracejadas representam pontos de dissecação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67966/67966fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67966/67966fig03.jpg"> 
Figura 3: Estágios de um experimento em modelo de bexiga in vitro . Imagens da câmara central modelo de bexiga in vitro , ao longo de diferentes estágios de experimentação. (A) AUM na câmara central do modelo de bexiga in vitro antes da inoculação. O meio na câmara central é completamente transparente, indicando esterilização bem-sucedida, e a ponta do cateter e os orifícios dos olhos são visíveis acima da linha do meio, indicando que o cateter está drenando com sucesso. (B) Meio na câmara central do modelo de bexiga in vitro após a inoculação com P. mirabilis (4 h pós-inoculação). A inoculação bem-sucedida é indicada pelo aumento da turbidez do meio. A visibilidade da ponta do cateter e dos orifícios dos olhos indica que o AUM está sendo drenado com sucesso através do cateter e que o bloqueio não ocorreu. (C) Um exemplo de um modelo de bexiga bloqueada in vitro . A inoculação com P. mirabilis e a subsequente formação e mineralização de biofilme resultaram no bloqueio dos orifícios oculares do cateter, impedindo a drenagem e fazendo com que o nível do meio na câmara central subisse acima da ponta do cateter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67966/67966fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67966/67966fig04.jpg"> 
Figura 4: As medições finais para um modelo de bexiga in vitro são executadas até o bloqueio. Exemplo de medições de endpoint no momento do bloqueio de um modelo de bexiga in vitro inoculado com uma cepa clínica de P. mirabilis, RS47 (WT), e uma cepa mutante com formação de biofilme atenuada, RS47-2 (Mutante). (A) Tempo de bloqueio (h) de WT e cepas mutantes de P. mirabilis. (B) pH de modelos de bexiga in vitro no momento do bloqueio. (C) UFC/mL de células planctônicas em câmara modelo de bexiga in vitro no momento do bloqueio. Todos os dados representam a média de cinco repetições biológicas. As barras de erro mostram o erro padrão da média (SEM). *p ≤ 0,05; **p ≤ 0,01. Essa figura foi modificada de Clarke et al.46. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67966/67966fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67966/67966fig05.jpg"> 
Figura 5: Medições de células associadas ao biofilme do modelo de bexiga in vitro . Quantificação da formação de biofilme de P. mirabilis , comparando a cepa selvagem HI4320 com populações adaptadas passadas com ou sem clorexidina (CHD) por meio de coloração violeta de cristal e medição da densidade óptica (OD) a 595 nm. PESO: P. mirabilis HI4320; 1, 3, 5: controles de passagem sem exposição a DCC; 2, 4, 6: HI4320 passou em 4 μg/mL CHD. Todos os dados representam a média de cinco repetições biológicas. As barras de erro mostram SEM. *p ≤ 0,05; **p ≤ 0,01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67966/67966fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67966/67966fig06.jpg"> 
Figura 6: Medições de modelos de bexiga in vitro após tratamento antimicrobiano. Amostras planctônicas foram retiradas de um modelo de bexiga in vitro inoculado com P. mirabilis, após irrigação com solução antimicrobiana de clorexidina a 0,02% (100 mL) ou controle salino a 0,9%. (A) Tempo de bloqueio de modelos de bexiga in vitro após irrigação. (B) UFC/mL planctônica imediatamente após o tratamento de irrigação. Todos os dados representam a média de cinco repetições biológicas. As barras de erro mostram SEM. *p ≤ 0,05; **p ≤ 0,01; *p ≤ 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67966/67966fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Um modelo de bexiga in vitro de infecção do trato urinário associada a cateter

Catheter-associated urinary tract infections (CAUTIs) are among the most common healthcare-associated infections. Biofilm formation on urinary catheters ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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