Um modelo de bexiga in vitro de infecção do trato urinário associada a cateter

- Nossa pesquisa está focada em infecções do trato urinário associadas a cateteres. Usamos modelos in vitro como o modelo da bexiga para entender melhor os patógenos que causam CAUTIs.

O modelo de bexiga in vitro fornece um ambiente controlado para testar as aplicações práticas de ferramentas diagnósticas e intervenções terapêuticas para uso no tratamento de CAUTI.

O trato urinário cateterizado é um nicho ambiental complexo com parâmetros importantes como a superfície do cateter e o ambiente nutricional da urina, que dificultam sua replicação in vitro.

Um dos principais objetivos de nossa pesquisa é encontrar maneiras de controlar a formação de biofilme em dispositivos médicos, como cateteres urinários, para melhorar os resultados para os pacientes. Também estamos usando nossos modelos para estudar o desenvolvimento de resistência antimicrobiana em comunidades bacterianas para responder a perguntas sobre como isso surge e o que podemos fazer para evitá-lo.

[Narrador] Para começar, insira um cateter de Foley na câmara de vidro central do modelo de bexiga in vitro e prenda o cateter no lugar após inflar o balão usando a seringa de água estéril fornecida. Em seguida, conecte o saco de lixo à porta do cateter antes de conectar o dispositivo modelo de bexiga in vitro ao reservatório AUM. Agora, conecte os modelos de bexiga in vitro aos suportes de grampo. Conecte a tubulação do circuito de mídia à bomba peristáltica e prenda os sacos de lixo nos suportes posicionados abaixo dos modelos. Conecte a câmara externa do modelo de bexiga a um banho-maria circulante usando tubos de silicone. Defina o banho-maria para aquecer a 37 graus Celsius e ligue os circuladores do tanque. Esterilize o modelo de bexiga in vitro usando etanol a 70%. Remova a tampa na entrada do meio para tornar a câmara interna acessível. Usando uma pipeta sorológica, remova 10 mililitros de AUM do volume do modelo da bexiga. Inocular os modelos de bexiga in vitro através da câmara central utilizando toda a suspensão normalizada de 10 mililitros e misturar bem. Com a pipeta, retirar 10 mililitros da amostra inoculada da câmara central e alíquota para um tubo universal de 15 mililitros para ensaios posteriores. Depois de descontaminar as superfícies externas, substitua a rolha e retome brevemente o fluxo de mídia para garantir que o nível de AUM na câmara central atinja o orifício do olho e, em seguida, interrompa o fluxo. Após uma incubação de uma hora, ligue o fluxo de meio usando a bomba peristáltica para começar a executar os modelos de bexiga in vitro. Após descontaminar a rolha modelo bexiga, remova-a para acessar a câmara central. Usando uma pipeta sorológica, misture suavemente o conteúdo da câmara central, evitando a ponta do cateter e o balão. Em seguida, remova um mililitro da amostra usando uma pipeta e alíquota em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro para diluições em série. Meça o pH da amostra restante usando um medidor de pH. Desconecte o saco de resíduos do cateter e drene qualquer urina residual do modelo esvaziando o balão. Remova o cateter da parte inferior do modelo usando uma pinça estéril. Agora, coloque o cateter removido em uma placa estéril e, usando um bisturi estéril, corte o cateter nos pontos necessários para a secção. Usando uma pinça estéril, mergulhe a seção do cateter três vezes em PBS estéril para remover as células não aderentes e incube a seção do cateter preparada em tripsina a 0,25% a 37 graus Celsius por 30 minutos. Após a incubação, sonicar a solução contendo o cateter durante 10 minutos. Usando a técnica asséptica, insira a extremidade da seringa contendo o agente lubrificante no colo do modelo de bexiga e injete cinco mililitros de gel. Gire o modelo para garantir que a base seja uniformemente revestida com gel. Para inserir um cateter de Foley no modelo, empurre a ponta do cateter através do gel e prenda-o após encher o balão normalmente. Conecte o modelo ao restante da configuração. Em seguida, encha o lúmen do modelo com urina até que comece a drenar pelo orifício do olho do cateter. Assim que a urina começar a escorrer, pare a bomba para evitar a perda de gel antes da inoculação. No ponto de ligar a bomba após as inoculações, coloque as diluições em placas para contagens de unidades formadoras de colônias. Se estiver usando uma bolsa de irrigação individual, desconecte o saco de lixo do cateter e use a tampa fornecida com a bolsa para selar o saco de lixo. Conecte imediatamente a bolsa de solução de irrigação ao cateter e, usando uma leve pressão, aperte o produto no lúmen central seguindo as instruções do fabricante por 15 minutos. Uma vez concluído o tempo de tratamento recomendado, deixe a solução residual escorrer da câmara interna através do orifício do olho do cateter para a bolsa de irrigação e, em seguida, desconecte a bolsa. Esterilize a porta de drenagem do cateter e a porta de conexão do saco de lixo com etanol a 70% antes de reconectá-los. Para encerrar o experimento, desligue o fluxo do banho-maria e desconecte o circuito de mídia e a tubulação do circuito do banho-maria dos modelos de bexiga in vitro. Depois de remover as rolhas, recolha todo o volume de urina residual, drene os sacos de lixo e descarte qualquer meio residual. Em seguida, desconecte os sacos de resíduos do cateter da porta do cateter e descarte-os. Por fim, usando uma seringa, esvazie lentamente os balões do cateter antes de removê-los dos modelos. Após a inoculação do modelo de bexiga, o tempo de bloqueio foi significativamente estendido na cepa mutante mini-Tn5 de Proteus mirabilis em comparação com a cepa do tipo selvagem, indicando redução da formação de biofilme. As unidades formadoras de colônias planctônicas por mililitro no momento do bloqueio foram significativamente reduzidas na cepa mutante mini-Tn5 em comparação com o tipo selvagem. A coloração com cristal violeta demonstrou que os isolados de Proteus mirabilis passados em clorexidina exibiram uma redução significativa na biomassa do biofilme em comparação com aqueles que passaram sem clorexidina. O tratamento de modelos de bexiga in vitro com irrigação com clorexidina a 0,02% estendeu significativamente o tempo de bloqueio e reduziu as unidades formadoras de colônias planctônicas por mililitro em comparação com controles não tratados e tratados com solução salina.