Cell-free Dot Blot como uma plataforma de imunoensaio prática e adaptável para a detecção da resposta de anticorpos em soros humanos e animais

Este protocolo demonstra a técnica de sangue de ponto livre de células, uma plataforma de imunoensaio adaptável, acessível e econômica desenvolvida em resposta à pandemia de COVID-19. Os métodos de imunoensaio padrão-ouro existentes incluem variações da técnica ELISA e ensaios de fluxo lateral. Tem havido um interesse significativo no desenvolvimento de novos imunoensaios usando tecnologias como proteínas relatadas divididas, interfaces eletroquímicas e nanopartículas coloidais.

O desafio é que a maioria dos imunoensaios padrão-ouro é inacessível a comunidades não centralizadas devido à dependência de componentes e equipamentos moleculares caros e sofisticados. Esta nova técnica de imunoensaio CFDB pode ser rapidamente adaptada a surtos emergentes. Ele usa equipamentos básicos de laboratório e depende inteiramente de componentes moleculares que podem ser produzidos internamente e em ambientes de poucos recursos.

Para começar, obtenha a sequência de proteínas do banco de dados UniProt usando o código de acesso P0DTC9. Código em otimizar a sequência para expressão baseada em ecoli usando o código IDT na ferramenta de otimização. Insira a sequência otimizada em um modelo SnapGene para a estrutura de construção de expressão antes de solicitar a sequência otimizada para síntese comercial como um fragmento de DNA de fita simples ressuspenso em água.

Realize um teste inicial de expressão em escala de cinco microlitros adicionando o produto de PCR de 10% à reação livre de células ecoli BL21 em um tubo de PCR. Incube a reação sem agitar a 30 graus Celsius por 15 horas. Avalie a qualidade da expressão da proteína do nucleocapsídeo ou antígeno NP carregando um microlitro da reação livre de células em gel de página 12% SDS e transfira-o para uma membrana de nitrocelulose para western blot.

Monte uma reação livre de células em escala de um mililitro usando um produto de modelo de expressão linear purificado de 15 nanomolares para o ensaio de mancha de ponto livre de células Incube a mistura de expressão em um tubo cônico de 15 mililitros com agitação a 80 RPM por 15 horas a 30 graus Celsius. Depois de avaliar a qualidade da expressão usando western blot e alíquota de 50 microlitros da mistura de expressão, armazene as alíquotas a menos 20 graus Celsius. Use uma imagem de grade mestra como mostrada, apresentando um padrão de seis por seis centímetros contendo 12 por 12 círculos, cada um com um diâmetro de dois milímetros, projetado para corresponder à capacidade de detecção de uma placa de 96 poços.

Depois de imprimir a grade mestra, coloque a grade impressa firmemente entre duas camadas de filme de teto de placa PCR adesiva, corte o sanduíche no tamanho certo ao longo das bordas externas da grade. Usando um punção de biópsia de dois milímetros, esvazie cada círculo marcado na grade. Corte um pedaço de membrana de nitrocelulose de 6,5 por 6,5 centímetros, posicione-o sob a grade mestra em uma superfície limpa e prenda-o com fita adesiva.

Usando uma caneta marcadora, marque as posições do círculo mais externo na membrana de nitrocelulose a ser usada como guia para cortar a membrana após a detecção da amostra. Dilua as amostras de soro de um a 10 em PBS. Usando uma micropipeta, dispense volumes triplicados de 0,4 microlitro de cada amostra na membrana de nitrocelulose em posições de grade predeterminadas.

Deixe as amostras manchadas se ligarem e secarem à temperatura ambiente por 10 minutos. Usando uma pinça, recupere cuidadosamente a membrana de nitrocelulose e corte-a ao longo dos círculos externos marcados. Transfira a membrana para uma placa de Petri de 10 centímetros contendo 10 mililitros de solução de bloqueio.

Incube em temperatura ambiente por 30 minutos, agitando suavemente a 100 RPM. Retirar do congelador a alíquota de 50 microlitros da mistura de expressão do antigénio sem células e, após a descongelação, adicioná-la a cinco mililitros de solução de bloqueio numa placa de Petri de 10 centímetros. Transferir a membrana directamente para esta solução contendo antigénio e incubar à temperatura ambiente durante uma hora, agitando a 100 RPM.

Após uma hora, enxágue e lave a membrana em TBST contendo 0,05% Tween 20. Em seguida, adicione 10 mililitros de tampão de bloqueio contendo 10 microgramas por mililitro de SpyCatcher purificado, dois ápices, duas proteínas, à membrana e coloque a membrana em um prato contendo o ápice do SpyCatcher. Incubar por uma hora com agitação a 100 RPM Depois de enxaguar a membrana com solução salina tamponada com tris ou TBS, lave duas vezes por cinco minutos em TBST, seguido de um enxágue final em TBS.

Cole e prenda um pedaço de parafilme em uma superfície de trabalho limpa perto do instrumento de imagem de borrão. Remova o excesso de líquido batendo na membrana e usando uma pinça, coloque-o em cima do parafilme. Adicione imediatamente três mililitros de quimioluminescência aprimorada ou solução ECL no topo da membrana e incube em temperatura ambiente por exatamente 90 segundos.

Após a secagem da membrana, transfira-a para um instrumento de imagem compatível com quimioluminescência. Use a função de análise de imagem do instrumento para obter intensidades pontuais, inclusive para três posições em branco na membrana de nitrocelulose. Mantenha um volume de medição constante por ponto.

Exporte os dados para uma planilha, garantindo a rotulagem correta de cada posição do ponto. Calcule a média e o desvio-padrão das intensidades pontuais triplicadas. Subtraia o fundo da membrana de nitrocelulose de todas as medições da amostra.

Em seguida, use a equação fornecida para obter um valor de corte para a interpretação de resultados positivos ou negativos. Por fim, plote os dados subtraídos de corte em um gráfico de barras. Um ensaio de dot blot livre de células foi realizado no humano comercial pré-caracterizado Sarah, e uma imagem do blot, juntamente com o gráfico de intensidade do sinal correspondente, é apresentada nesta figura.

O ensaio de dot blot livre de células identificou com sucesso todas as amostras de controle negativo e a maioria das amostras positivas. Testes independentes do ensaio de dot blot livre de células no Laboratório Nacional de Microbiologia identificaram corretamente todas as 12 amostras de pacientes negativas e 12 positivas, confirmando sua robustez. O ensaio de dot blot livre de células também detectou respostas de anticorpos na hamster infectada com SARS-CoV-2 Sarah, com sinais positivos observados em 18 das 24 amostras pós-infecção coletadas cinco dias após a reinfecção, enquanto todas as amostras pré-infecção permaneceram negativas.