Name: Cell-free Dot Blot como uma plataforma de imunoensaio prática e adaptável para a detecção da resposta de anticorpos em soros humanos e animais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-23T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Aprenda a técnica de dot blot livre de células para imunoensaio acessível e adaptável, permitindo detecção de anticorpos em soros humanos e animais com equipamentos básicos.

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Todos os experimentos com hamsters foram realizados no Laboratório Nacional de Microbiologia (NML) da Agência de Saúde Pública do Canadá, aprovados pelo Centro Canadense de Ciências para Saúde Humana e Animal e seguindo as diretrizes do Conselho Canadense de Cuidados com Animais. Todas as amostras de soro/plasma humano foram obtidas comercialmente para testes internos ou fornecidas por colaboradores clínicos ao NML para testes independentes no NML.
1. Conceção e preparação de modelos de expressão linear de antigénio (LETs)
<ol>
	<li>Projete os LETs de expressão livre de células para o antígeno alvo com base nas instruções de Norouzi et al.7 e contendo um SpyTag N/C-terminal, conforme descrito em Norouzi et al.5. NOTA: Aqui fornecemos detalhes para a preparação da proteína do nucleocapsídeo SARS-CoV-2 (NP, aminoácidos 2-419).<ol>
		<li>Certifique-se de que o LET para o SARS-CoV-2 NP (Figura 1 e Arquivo Suplementar 1) contém locais de 5' e 3' Ter com uma sequência de buffer de 50 pares de bases antes do promotor T7 e após o códon de parada.</li>
		<li>Marque a proteína NP no terminal N com His 6-SpyTag-TEV.</li>
		<li>Obtenha a sequência de proteínas do banco de dados UniProt (código de acesso P0DTC9) e otimize-a para expressão baseada em E. coli usando a ferramenta de otimização de códonsIDT 8. Encomende esta sequência para síntese comercial como um fragmento de DNA de fita simples ressuspenso em água a 10 ng / μL. NOTA: O local de clivagem da protease TEV e a etiqueta His6 não são características essenciais no design do LET.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>A PCR amplifica o fragmento de DNA com o Ter FW universal (GGCTCCGAATAAGTATGTTGTAACTAAAAGTGCGGCC ACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCG) e Ter RV (CCGAGGCAATAAGTATGTTGTAACTAAAAGTGCTCAG CTTCCTTTCGGGCTTTGTTAGCAGCC) usando o kit de DNA polimerase de alta fidelidade (consulte a Tabela de Materiais)<ol>
		<li>Configure uma reação de 100 μL da seguinte forma: 75 μL de água livre de nuclease, 20 μL de tampão 5x DNA polimerase, 2 μL de 10 mM dNTPs (concentração final de 200 μM), 0,5 μL de primer 100 μM Ter-FW, 0,5 μL de primer Ter-RV 100 μM, 1 μL de LET de fita simples 10 ng/μL, 1 μL(2U) de DNA polimerase.</li>
		<li>Use as seguintes configurações de PCR: desnaturação inicial a 98 °C por 30 s; 35 ciclos: 98 °C durante 6 s, 60 °C durante 15 s, 72 °C durante 90 s; manter a 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Purifique o produto de PCR usando um kit de purificação de PCR comercial, verifique sua qualidade executando uma amostra em um gel de agarose a 1% e meça sua concentração em um espectrofotômetro UV-Vis. NOTA: Os produtos brutos de PCR também podem ser usados diretamente para expressão livre de células. No entanto, a purificação permite um procedimento mais padronizado.</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67973/67973fig01.jpg"> 
Figura 1: Modelo de expressão linear para SARS-CoV-2-NP. Um esquema representando as características do modelo de DNA linear His-SpyTag-SARS-CoV-2 NP. Os principais elementos do molde de DNA são rotulados. A sequência de codificação da proteína de interesse, aqui a NP, é colocada sob o controle transcricional de um promotor T7 para expressão eficiente. No terminal N, a proteína NP é anexada com um SpyTag para detecção específica usando o reagente de detecção SpyCatcher2-Apex2. Os locais de protease x6His-tag e TEV, embora incluídos como parte do projeto geral do LET, são dispensáveis para fins de CFDB. Nos terminais do molde de DNA linear, os sítios Ter "a montante" e "a jusante", cada um precedido pelas respectivas sequências tampão de 50 pares de bases, são incluídos para proteção mediada por Tus contra a degradação do DNA exonucleolítico no lisado livre de células. Abreviaturas: NP = proteína do nucleocapsídeo; LET = modelo de expressão linear; TEV = vírus da corrosão do tabaco; CFDB = dot blot livre de células. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67973/67973fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
2. Purificação da proteína repórter SpyCatcher2-Apex2
<ol>
	<li>Use o plasmídeo pET24b-SpyCatcher2-Apex2, originalmente construído em Norouzi et al.5 (sequência completa no Arquivo Suplementar 2 e mapa de plasmídeo na Figura Suplementar S1) para preparar a proteína repórter SpyCatcher2-Apex-2.</li>
	<li>Prepare placas de ágar e caldo de lisogenia (LB) contendo 50 μg / mL de canamicina. Transforme as células BL21 (DE3) de E. coli com o plasmídeo pET24b-SpyCatcher2-Apex2. Inocular uma única colónia numa cultura inicial de 15 ml de LB e crescer durante a noite a 37 °C com agitação a 250 RPM.</li>
	<li>No dia seguinte, adicione 10 mL da cultura inicial em 500 mL de meio LB fresco contendo 50 μg / mL de canamicina. Incubar a 37 °C com agitação a 250 RPM até que a cultura atinja uma densidade óptica a 600 nm de 0,6-0,8 (~3 h).</li>
	<li>Induza a expressão de SpyCatcher2-Apex2 suplementando a cultura com 0,5 mM de isopropil-β-D-1-tiogalactopiranosídeo e 1 mM de cloridrato de ácido 5-aminolevulínico. Reduzir a temperatura de crescimento para 30 °C e deixar incubar a cultura durante mais 4 h.</li>
	<li>Colha as bactérias por centrifugação a 8.000 × g por 15 min. Proceder à lise celular ou, em alternativa, conservar o pellet a -80 °C até à utilização.</li>
	<li>Ressuspenda o pellet em 20 mL de tampão de lise contendo 50 mM de Tris-HCl (pH 7,8), 300 mM de NaCl, 1 mg/mL de lisozima, comprimido inibidor de protease sem EDTA e 1 mM de ditiotreitol (DTT). Lisar as células por sonicação a 50 % de amplitude com intervalos de 5 s ON e 10 s OFF para um tempo total de ON de 3 min.</li>
	<li>Clarificar o lisado por centrifugação a 20.000 × g durante 1 h a 4 °C. Passe o sobrenadante por um filtro de seringa de 0,2 μm.</li>
	<li>Adicionar cloreto de hemina a uma concentração final de 250 μM ao lisado clarificado e incubar durante a noite a 4 °C. Prossiga para a purificação de proteínas. NOTA: A incubação com cloreto de hemina maximiza a incorporação de heme na peroxidase Apex-2 para uma atividade enzimática ideal.</li>
	<li>Adicione 2,5 ml de resina de Ni ao lisado clarificado e incube a 4 °C com agitação suave durante 45 min. Aplique a mistura em uma coluna de fluxo por gravidade e lave a resina com 50 mL de tampão Tris (50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 300 mM NaCl e 1 mM DTT).</li>
	<li>Eluir a proteína SpyCatcher2-Apex2 em 25 mL de tampão Tris contendo 400 mM de imidazol. Concentre e troque o eluído em tampão Tris usando uma unidade de filtro centrífugo, visando um volume final de 0,5-1,0 mL.</li>
	<li>Use o coeficiente de extinção molar de SpyCatcher2-Apex2 (27.390 M-1 cm-1) para determinar a concentração de proteína em um espectrofotômetro UV-Vis. Adicione glicerol a uma concentração final de 40% e armazene as alíquotas a -20 °C. NOTA: Espera-se que este protocolo produza aproximadamente 40 mg de SpyCatcher2-Apex2 altamente puro e ativo, suficiente para 400 execuções de CFDB em um tamanho de borrão padrão de 96 amostras.</li>
	<li>Para detecção de proteínas SpyTagged usando western blot9 convencional e para experimentos CFDB, sempre bloqueie as membranas em leite em pó desnatado a 5% em 1x solução salina tamponada com Tris contendo 0,05% de Tween-20 (TBST). Use a proteína SpyCatcher2-Apex2 em uma concentração final de 10 μg/mL em solução de bloqueio. NOTA: O repórter SpyCatcher2-Apex2 requer uma solução de quimioluminescência aprimorada (ECL) para o desenvolvimento do sinal. A solução de ECL pode ser obtida comercialmente ou preparada internamente de acordo com as instruções de Mruk et al.10. A solução final de ECL aqui consiste em 0,4 mM de ácido p-cumárico, 2,5 mM de luminol e 0,015% de H2O2 em 100 mM de Tris-HCl (pH 8,6).</li>
</ol>
3. Produção sem células e verificação da qualidade dos antigénios
<ol>
	<li>Prepare e monte um lisado de expressão livre de células E . coli BL21 e componentes de reação seguindo as instruções em Levine et al.11 e Norouzi et al.5. Suplementar a mistura de reação final com 5 μM de proteína Tus e 1,2 μM de RNA polimerase T7 da seguinte forma para uma reação representativa de 100 μL: 14,6 μL de solução A, 14 μL de solução B, 33,3 μL de lisado BL21 de E. coli , 2,5 μL de proteína Tus 200 mM, 1,2 μL de RNA polimerase T7 100 mM, 1 μL de molde de DNA linear de 1,5 μM, 33,4 μL de água livre de nuclease. NOTA: Consulte o Arquivo Suplementar 3 para obter instruções importantes sobre a preparação de um lisado livre de células E . coli BL21 e a Tabela Suplementar S1 para obter uma receita detalhada das Soluções A e B. O sistema de expressão livre de células de E. coli também pode ser preparado usando protocolos alternativos ou obtido comercialmente, desde que a reação seja suplementada com Tus e T7 RNA Polimerase.</li>
	<li>Realize um teste inicial de expressão em escala de 5 μL adicionando 10% (v / v) de produto de PCR bruto à reação livre de células em um tubo de PCR. Incubar sem agitar a 30 °C durante 15 h.</li>
	<li>Verificar a qualidade da expressão do antigénio NP carregando 1 μL da reacção sem células num gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sódio a 12% (SDS-PAGE) e, em seguida, transferi-lo para uma membrana de nitrocelulose para western blot, conforme descrito no passo 2.12. Use a proteína repórter SpyCatcher2-Apex2 para marcação de manchas por meio do SpyTag e, opcionalmente, um anticorpo comercial específico (aqui um anti-SARS-CoV-2-NP) contra o antígeno alvo.</li>
	<li>Monte uma reação livre de células em escala de 1 mL com produto LET purificado de 15 nM para ser usado para o ensaio CFDB. Incubar a mistura de extração num tubo cónico de 15 ml, agitando a 80 RPM durante 15 h a 30 °C. Verificar a qualidade da expressão com western blot e armazenar alíquotas de 50 μL a -20 °C.</li>
</ol>
4. Amostras de soro
<ol>
	<li>Obtenha amostras de soro (ou plasma) humano/animal de fontes comerciais ou colaboradores clínicos ou internamente usando procedimentos padrão e seguindo as diretrizes do comitê institucional de ética em pesquisa humana ou do comitê de cuidados e uso de animais. Garantir que as medidas apropriadas de pré-tratamento da amostra foram tomadas para mitigar os riscos de contaminação. NOTA: As medidas de pré-tratamento podem incluir tratamento com solvente-detergente, inativação por calor e teste de marcadores de vírus transmitidos pelo sangue. Um protocolo útil para isolamento de soro e plasma de sangue total está disponível12. Tal como acontece com outras plataformas de imunoensaio, não se espera que as amostras de soro coletadas precocemente (&lt;3 semanas) após a infecção inicial ou o início da doença contenham níveis adequados de resposta de anticorpos e seus resultados devem ser tratados com cautela.</li>
	<li>Para verificação da qualidade dos reagentes SARS-CoV-2 NP CFDB, use o painel de referência internacional do Instituto Nacional de Padrões e Controle Biológico (NIBSC) da Organização Mundial da Saúde (OMS) para imunoglobulina anti-SARS-CoV-2, que contém x1 amostras pré-COVID-19 e x4 SARS-CoV-2-positivas com níveis variados de imunoglobulinas anti-NP13. Como alternativa, use amostras de soro saudáveis e positivas pré-caracterizadas de outras fontes.</li>
	<li>Para experimentos CFDB, obter ou preparar uma amostra de controle negativo agrupando várias (&gt;3) amostras de soro saudáveis para aumentar a precisão e facilitar a análise e interpretação dos resultados.</li>
</ol>
5. Procedimento de Cell-free Dot Blot (CFDB)
<ol>
	<li>Baixe e imprima o arquivo de imagem da grade mestra (Figura Suplementar S2). A grade mestra é um padrão de 6 x 6 cm contendo 12 x 12 círculos de 2 mm de diâmetro cada e fornece uma capacidade de localização semelhante a uma placa de 96 poços.</li>
	<li>Coloque a grade firmemente entre duas camadas de filme de vedação de placa PCR adesiva e corte no tamanho certo ao longo das bordas externas da grade. Use um punção de biópsia de 2 mm para esvaziar cada círculo marcado. NOTA: Esta grade mestra pode ser reutilizada várias vezes após a limpeza com etanol 70%.</li>
	<li>Corte um pedaço de membrana de nitrocelulose de 6.5 x 6.5 cm e posicione-o sob a grade mestre em uma superfície limpa, prendendo a configuração usando fita adesiva conforme mostrado na Figura 2 e na Figura Suplementar S3. Use uma caneta marcadora para marcar as posições do círculo mais externo na membrana de nitrocelulose a ser usada como guia para cortar a membrana após a detecção da amostra.</li>
	<li>Dilua as amostras de soro 1/10 em 1x solução salina tamponada com fosfato (pH 7,4). Use uma micropipeta para dispensar volumes triplicados de 0,4 μL de cada amostra na membrana de nitrocelulose em posições de grade predeterminadas. Levará aproximadamente 15 s por ponto para dispensar. NOTA: Certifique-se de incluir amostras de controle negativas e positivas em cada ensaio, pois isso será necessário para a análise dos resultados.</li>
	<li>Aguarde 10 minutos em temperatura ambiente para que as amostras manchadas se liguem e sequem. Usando uma pinça, recupere cuidadosamente a membrana de nitrocelulose e corte ao longo dos círculos externos marcados.</li>
	<li>Bloquear a membrana em 10 mL de solução bloqueadora (5% de leite em pó desnatado em TBST) em uma placa de Petri de 10 cm por 30 min em temperatura ambiente, agitando suavemente a 100 RPM.</li>
	<li>Descongelar e adicionar uma alíquota de 50 μL da mistura de expressão do antigénio sem células a 5 ml de solução de bloqueio numa placa de Petri de 10 cm. Transferir a membrana directamente para esta solução contendo antigénio e incubar à temperatura ambiente durante 1 h, agitando a 100 RPM. NOTA: Esta será a etapa de detecção primária em que o antígeno SpyTagged se ligará a posições pontuais contendo anticorpos, se presentes.</li>
	<li>Enxágue a membrana, lave por 5 min e enxágue novamente em TBST antes de prosseguir para a etapa de detecção secundária.</li>
	<li>Incube a membrana em 10 mL de tampão de bloqueio contendo 10 μg / mL de proteína SpyCatcher2-Apex2 purificada, por 1 h agitando a 100 RPM.</li>
	<li>Enxágue a membrana e lave 2 x 5 min em TBST, com um enxágue final em TBS.</li>
	<li>Cole e prenda um pedaço de parafilme em uma área de trabalho limpa perto do instrumento de imagem de borrão. Remova o excesso de líquido batendo na membrana com uma pinça e coloque a membrana em cima do parafilme.</li>
	<li>Adicione imediatamente 3 mL (100 μL / cm2) de solução de ECL no topo da membrana e incube em temperatura ambiente por exatamente 90 s.</li>
	<li>Seque imediatamente a membrana e transfira para um instrumento de imagem compatível com quimioluminescência para visualização dos resultados. NOTA: O tempo ideal de imagem pode variar em diferentes instrumentos. Recomenda-se usar as configurações padrão de tempo de aquisição automática do instrumento e, se ausente, usar amostras de soro pré-caracterizadas para otimizar o tempo de aquisição da imagem.</li>
	<li>Use a função de análise de imagem do instrumento para obter intensidades pontuais, inclusive para três posições em branco (fundo) na membrana de nitrocelulose; Mantenha um volume de medição constante por ponto. Exporte os dados para uma planilha, lembrando-se de rotular corretamente cada posição pontual.</li>
	<li>Calcule a média e o desvio padrão (DP) das intensidades pontuais triplicadas. Em seguida, subtraia o fundo da membrana de nitrocelulose de todas as amostras.</li>
	<li>Use a seguinte equação para obter um valor de corte para a interpretação dos resultados -/+: (Média dos controles negativos) + (3 x DP dos controles negativos). Considere as amostras positivas se sua intensidade média cair acima do valor de corte e negativas se sua intensidade média cair abaixo do valor de corte. NOTA: Um esquema do procedimento CFDB é fornecido na Figura 3.</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67973/67973fig02.jpg"> 
Figura 2: Montagem CFDB. Um esquema da grade mestre CFDB e da configuração da montagem da membrana NC. A grade mestra é sobreposta à membrana NC para fornecer um padrão regular e endereçável para detecção e imobilização de amostras de soro. Abreviaturas: CFDB = dot blot livre de células; NC = nitrocelulose. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67973/67973fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67973/67973fig03.jpg"> 
Figura 3: Uma representação esquemática do fluxo de trabalho do CFDB. Em um ensaio CFDB, uma pequena quantidade (&lt;0,4 μL) de amostras de soro diluídas 10x é dispensada manualmente em uma membrana de nitrocelulose pré-cortada (painel esquerdo) em locais discretos e endereçáveis (painel do meio). Depositar uma amostra de soro por ponto em pontos triplicados e imobilizar o conteúdo proteico, incluindo o reservatório total de anticorpos do soro, no substrato NC sólido (pontos bege no painel central). Neste exemplo, os anticorpos anti-NP contidos nas amostras de soro podem ser primeiro ligados pelo reagente de detecção primária CFDB SpyTag-NP e, finalmente, detectados pelo reagente de detecção secundária CFDB SpyCatcher2-Apex2 (bolha ampliada no painel direito). Essa figura foi retirada de Norouzi et al.5. Abreviaturas: CFDB = dot blot livre de células; NP = proteína do nucleocapsídeo; LET = modelo de expressão linear. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67973/67973fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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</ol>

<table><tbody><tr><td>Escada de DNA de 1 kb</td><td>NEB</td><td>N3232</td><td>Usado como marcador de tamanho para géis de agarose</td></tr><tr><td>20 Aminoácidos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>LAA21-1KT</td><td>Um componente da reação livre de células Solução B</td></tr><tr><td>2 mm punção de biópsia&nbsp;</td><td>Integra Miltex&nbsp;</td><td>33-31-P/25</td><td>Para preparação de</td></tr><tr><td>cloridrato de ácido 5-aminolevulínico CFDB master grid&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3785</td><td>Precursor Heme para indução de SpyCatcher2-Apex2 Pó de</td></tr><tr><td>agarose</td><td>BioShop</td><td>AGA002</td><td>Para análise eletroforética de DNA</td></tr><tr><td>Anti-SARS-CoV2-Nucleocapsídeo anticorpo</td><td>Sinobiológico</td><td>40588-T62</td><td>Para detecção WB de antígeno NP produzido sem células</td></tr><tr><td>Bio-Rad ChemiDoc&nbsp; XRS+</td><td>Bio-Rad</td><td>N/A</td><td>Instrumento de imagem em gel</td></tr><tr><td>Concentradores centrífugos</td><td>Cytiva</td><td>28-9323-60</td><td>Para concentração e troca tampão de proteínas</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>EP022628257</td><td>Para colheita de cultura bacteriana</td></tr><tr><td>Coenzima&nbsp; Um hidrato de sal de sódio (CoA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3144</td><td>Um componente da solução de reação livre de células Um</td></tr><tr><td>padrão de proteína pré-corada (ampla gama)</td><td>NEB</td><td>P7719</td><td>Usado como marcador de tamanho para géis SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Painel de soro Covid-19</td><td>RayBiotech</td><td>CoV-PosSet</td><td>Soros pré-caracterizados para verificação e otimização de reagentes/condições</td></tr> <tr><td>CFDBD-(&menos;)-Sal dissódico do ácido 3-fosfoglicérico (3-PGA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8877</td><td>Um componente da reação livre de células Solução B</td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10197777001</td><td>Componente dos tampões</td></tr><tr><td>E. coli 5-alfa</td><td>NEB</td><td>C2987&nbsp;</td><td>para preparação de plasmídeo</td></tr><tr><td>E. coli BL21</td><td>NEB</td><td>C2530&nbsp;</td><td>Para a preparação de lisados livres de células</td></tr><tr><td>E. coli BL21 (DE3)</td><td>NEB</td><td>C2527&nbsp;</td><td>Para expressão do SpyCatcher2-Apex2</td></tr><tr><td>Comprimido inibidor de protease livre de EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11836153001</td><td>Um componente do tampão de lise de E. coli</td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp; Nova Brunswick Incubadora Innova 43/43R Shaker</td><td>Eppendorf</td><td>EPM1320</td><td>Incubadora para crescimento de células de E. coli para expressão de proteínas e preparação de lisado livre de células</td></tr><tr><td>Ácido folínico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47612</td><td>Um componente da reação livre de células Solução A</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012</td><td>Componente do buffer de armazenamento SpyCatcher2-Apex2</td></tr><tr><td>Cloreto de hemina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9039&nbsp;</td><td>Para a suplementação Heme de SpyCatcher2-Apex2</td></tr><tr><td>Peróxido de hidrogênio 30%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009</td><td>Para fazer reagente ECL</td></tr><tr><td>Software de Laboratório de Imagem</td><td>Software de 1709690 Bio-Rad</td><td></td><td>para instrumento de imagem de gel ChemiDoc</td></tr><tr><td>Isopropil-b-D-1-tiogalactopiranosídeo&nbsp;</td><td>Bioshop</td><td>IPT001</td><td>Para indução de SpyCatcher2-Apex2 expressikon</td></tr><tr><td>Kanamycin Sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td>Para preparação de cultura bacteriana SpyCatcher2-Apex2</td></tr><tr><td>LB agar</td><td>BioShop</td><td>LBL406</td><td>Para crescimento de E. coli</td></tr><tr><td>Caldo LB</td><td>BioShop</td><td>LBL407</td><td>Para E. coli crescimento</td></tr><tr><td>luminol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4685</td><td>Para fazer reagente ECL</td></tr><tr><td>Lisozima</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td>Para lise de células bacterianas</td></tr><tr><td>Acetato de Magnésio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5661</td><td>Um componente da reação livre de células Solução B</td></tr><tr><td>NEBExpress Resina Ni&nbsp;</td><td>NEB</td><td>S1428S</td><td>Para purificação de SpyCatcher2-Apex2</td></tr><tr><td>Leite em pó desnatado</td><td>Bioshop</td><td>SKI400</td><td>Para bloqueio de membranas WB e CFDB</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>2099-1337410</td><td>Para ECL-incubação de CFDB borra</td></tr><tr><td>ácido p-cumárico&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9008</td><td>Para fazer o reagente ECL</td></tr><tr><td>pET24b-SpyCatcher2-Apex2 plasmid</td><td>Pardee Laboratory</td><td>N/A</td><td>Usado para a expressão da proteína SpyCatcher2-Apex2</td></tr><tr><td>Placa de Petri</td> Recipiente <td>FB0875712</td> da <td>Fisherbrand</td><td>para incubação de membrana WB e CFDB&nbsp;</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato 10%</td><td>BioShop</td><td>PBS405</td><td>Componente dos tampões</td></tr><tr><td>Glutamato de potássio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1501</td><td>Um componente da reação livre de células Solução B</td></tr><tr><td>Oxalato de potássio monohidratado (ácido oxálico)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223425</td><td>Um componente da reação livre de células Solução A</td></tr><tr><td>Gel SDS-PAGE pré-moldado</td><td>BioRad</td><td>4561036EDU</td><td>Para análise eletroforética da</td></tr><tr><td>proteína Q5 DNA polimerase de alta fidelidade&nbsp;</td><td>NEB</td><td>M0491&nbsp;</td><td>Para amplificação por PCR de LETs</td></tr><tr><td>Kit de purificação de PCR QIAquick&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>Para purificação de LETs</td></tr><tr><td>Conjunto de solução de ribonucleotídeo</td><td>NEB</td><td>N0450S</td><td>Um componente da solução de reação livre de células A</td></tr><tr><td>Leite em pó desnatado</td><td>BioShop</td><td>SKI400</td><td>Usado como agente bloqueador para western blot e CFDB</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td>Um componente de tampões de purificação de proteínas</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Qsonica</td><td>Q500</td><td>Para lise de células bacterianas</td></tr><tr><td>Espermidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2626</td><td>Um componente da reação sem células Solução A Filtro de</td></tr><tr><td>seringa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLGSR33SS</td><td>Para esterilização de tampões e soluções</td></tr><tr><td>Termociclador</td><td>BioRad</td><td>T100</td><td>Instrumento para incubação de reações de PCR</td></tr><tr><td>RNA de transferência (tRNA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8759</td><td>Um componente da solução salina tamponada com células A</td></tr><tr><td>Tris Thermo</td><td>Scientific</td><td>J60764. K2</td><td>Componente do tampão de lavagem WB e CFDB</td></tr><tr><td>Base Trizma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>Para fazer tampão tris</td></tr><tr><td>Tunair SS-5012 Frasco de agitação de meio defletor, 2,5 L</td><td>Cole-Parmer</td><td>RK-01835-39</td><td>Recipiente para o cultivo de células de E. coli para expressão de proteínas e preparação de lisado livre de células</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>BioShop</td><td>TWN510</td><td>Componente do tampão de lavagem WB e CFDB</td></tr><tr><td>Pinça</td><td>Almedic</td><td>7728-A10-100</td><td>Para o manuseio</td></tr> de <tr><td>espectrofotômetro UV-Vis</td> de membrana CFDB NC <td>Thermo Scientific</td><td>13400518</td><td>Usado para a medição da concentração de ácido nucleico e DNA e cultura bacteriana OD</td></tr><tr><td>Painel de Referência Internacional da OMS para imunoglubulina anti-SARS-CoV-2</td><td>NISBC</td><td>20/268</td><td>Soros pré-caracterizados para verificação e otimização de reagentes/condições</td></tr> <tr><td>CFDBHidrato de dinucleotídeo de &beta;-nicotinamida adenina (NAD)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10127965001</td><td>Um componente da solução de reação livre de células</td></tr></tbody></table> A

cell-free dot blot como uma plataforma de imunoensaio prática e adaptável para a detecção da resposta de anticorpos em soros humanos e animais

Cell-Free Dot Blot as a Practical and Adaptable Immunoassay Platform for the Detection of Antibody Response in Human and Animal Sera

Amplificação por PCR do modelo de expressão linear para antígeno alvo Para amplificar o SARS-CoV-2 NP LET, foram utilizados primers universais Ter direto e reverso conforme descrito na seção 1.2 do protocolo e 1 μL do produto foi verificado em um gel de agarose (Figura 4) antes de prosseguir para a purificação do produto de PCR.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67973/67973fig0...

Cell-free Dot Blot como uma plataforma de imunoensaio prática e adaptável para a detecção da resposta de anticorpos em soros humanos e animais

The string of global pathogenic outbreaks over the past two decades has highlighted the importance of serosurveillance strategies. Immunoassay platforms ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Usando a tecnologia Luminex Corporation microesfera xMAP, desenvolvemos o imunoensaio multiplexado fluorométrico (MFIA) para serovigilância de várias espécies de animais de laboratório. O MFIA é um microarray de suspensão onde o antigénio controlo de tecido, ou imunoglobulinas são ligados covalentemente a um código de cores de poliestireno microesferas. O método de ensaio MFIA, bem como vários tópicos de resolução de problemas é abordada.

Multiplexados Metodologia de Testes de imunoensaio fluorimétrico e solução de problemas

Este vídeo descreve uma técnica de imunoensaio usando esferas magnéticas fluorescentes ou microesferas acopladas a diferentes antígenos para detectar simultaneamente vários isotipos de anticorpos em uma amostra de soro. O ensaio é útil para entender a soroconversão durante uma infecção ou pós-vacinação.

Ensaio de Imunoesferas Multianalita: Uma Técnica de Imunoensaio Baseada em Fluxo para Detecção Simultânea de Vários Subtipos de Anticorpos em Amostra de Soro Humano

Este protocolo descreve o desenvolvimento de dois anticorpos monoclonais (mAbs) da classe IgG fortemente reativos à mioglobina de cetáceos. Esses mAbs são aplicados em uma tira de teste imunocromatográfica de ouro coloidal baseada no formato sanduíche para diferenciar o Mb de cetáceos de focas e outros animais.

Desenvolvimento de uma tira de teste imunocromatográfico baseada em ouro coloidal para a detecção de Cetáceos Myoglobin

O sangue periférico humano é comumente usado para a avaliação da resposta imune humoral. Aqui, são descritos os métodos para isolar células B humanas do sangue periférico, diferenciar células B humanas em células B secretoras de anticorpos (Ab) (ASCs) em cultura e enumerar o total de IgM- e IgG-ASCs por meio de um ensaio ELISpot.

O isolamento, a diferenciação e a quantificação de anticorpo humano secretoras de células B de sangue: ELISpot como uma leitura funcional de Imunidade Humoral

Vamos demonstrar uma tecnologia de chip de snap para a realização de imunoensaios sanduíche multiplexado cross-reactivity-livre simplesmente estalar dois slides. Um aparelho de pressão é usado para transferência fiável de reagentes de microarray-para-microarray. O chip de pressão pode ser usado para qualquer reações bioquímicas que exigem colocalization de diferentes reagentes sem contaminação.

Snap o Chip para imunoensaios livre de Cross-reactivity e Spotter sanduíche multiplexado

Aqui vamos demonstrar um processo detalhado de análise de borrão ponto quantitativa (QDB) determinando o conteúdo absoluto de uma proteína alvo, tampando a proteína actina, como gelsolin (CAPG), em três tecidos diferentes do rato. Vamos demonstrar um alto throughput, conveniente, quantitativos immunoblot técnica para validação de biomarcador no nível celular e tecido.

Alto Throughput, absoluta determinação do conteúdo de uma proteína selecionada em níveis de tecido usando quantitativa Dot Blot Analysis (QDB)

Neste trabalho, descrevemos um protocolo para caracterizar T-dependentes e T-independentes respostas do isotipo de imunoglobulina (Ig) em camundongos usando ELISA. Este método usado sozinho ou em combinação com fluxo cytometry permitirá que os investigadores a identificar diferenças nas respostas de isotipo Ig mediada por células B em camundongos após imunização de antígenos T-dependentes e T-independentes.

Caracterização das respostas de isotipo de imunoglobulina Timo-dependentes e Timo-independente nos ratos usando ensaio enzima-lig da imunoabsorção

Este artigo descreve um método conveniente para monitorar mudanças dinâmicas em tituladores de anticorpos para dois isótipos de imunoglobulina simultaneamente (IgA, IgM ou IgG) resultante de uma resposta imune à infecção ou vacinação SARS-CoV-2. Este 'Multianalyte Covid-19 Immune Response Panel' emprega três imunoensaias indiretas baseadas em microesferas codificadas que são lidas usando um leitor multiplex baseado em fluxo com capacidade de 'canal duplo'.

Monitoramento Dinâmico da Soroconversão usando um Ensaio de Imunobead Multianalyte para Covid-19

Este protocolo descreve uma metodologia para a preparação de esferas de látex para ensaios utilizando anticorpos IgY para detecção de antígenos.

Padronização de um ensaio citométrico de esferas baseado em anticorpos contra gema de ovo

Os imunoensaios baseados no sangue total fornecem uma ferramenta fácil e eficiente em termos de recursos para analisar a imunidade específica do antígeno para fins de diagnóstico e pesquisa. Este artigo fornece um protocolo otimizado baseado em sangue total com co-estimulação dupla para análise abrangente da imunidade do hospedeiro a patógenos fúngicos e virais, incluindo uma versão de baixo volume para pacientes pediátricos e pequenos animais.

Ensaio de sangue total com coestimulação dupla para análise específica do antígeno da imunidade do hospedeiro a patógenos fúngicos e virais

Apresentamos um ensaio ELISA sanduíche validado usando novos anticorpos monoclonais anti-HER2. Este ensaio permite a quantificação precisa da proteína HER2 ligada e liberada a partir de células cultivadas in vitro e outras amostras, incluindo sangue e tecidos.

Ensaio imunoquímico validado para determinação abrangente do receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano liberado e ligado às células

Aprenda a técnica de dot blot livre de células para imunoensaio acessível e adaptável, permitindo detecção de anticorpos em soros humanos e animais com equipamentos básicos.

Cell-free Dot Blot como uma plataforma de imunoensaio prática e adaptável para a detecção da resposta de anticorpos em soros humanos e animais (Vídeo) | JoVE Journal

Cell-free Dot Blot como uma plataforma de imunoensaio prática e adaptável para a detecção da resposta de anticorpos em soros humanos e animais

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