Isolamento, Fixação e Caracterização de Leucócitos Renais Juvenis de Cabeça de Dourada por Citometria de Fluxo

Este protocolo padroniza o isolamento, fixação e avaliação da viabilidade de leucócitos do rim da cabeça de dourada por citometria de fluxo, permitindo o processamento de amostras de alto rendimento sem comprometer a qualidade.

Técnicas tradicionais como contagem manual de células com câmaras de Neubauer e esfregaços de sangue corados são comuns na imunologia de peixes. A citometria de fluxo está se tornando popular, mas sua aplicação em estudos com peixes permanece limitada. Os métodos tradicionais de imunologia de peixes são intensivos em fígado e propensos a erros. Estudos com animais juvenis são limitados por desafios na obtenção de leucócitos puros e pela necessidade de avaliação imediata da viabilidade, restringindo o rendimento da amostra.

Este protocolo permite uma análise detalhada das células imunes, identificando as principais populações de leucócitos e distinguindo as células vivas das mortas. A fixação preserva a viabilidade por um mês, permitindo fluxos de trabalho de citometria de fluxo escaláveis, flexíveis e eficientes.

Nossas descobertas avançam a imunologia dos peixes, revelando mecanismos imunológicos e impactos ambientais na viabilidade celular, auxiliando no desenvolvimento de estratégias aprimoradas de manejo de doenças na aquicultura.

[Narrador] Para começar, aclimatar o sargo juvenil, Sparus aurata, em sistemas de aquicultura de recirculação, onde a água é continuamente filtrada e recirculada para manter um ambiente estável. Certifique-se de que o sistema inclua filtragem mecânica e biológica, aeração e controle de temperatura para manter os parâmetros abióticos ideais. Ajuste fatores ambientais, como fotoperíodo, temperatura, salinidade, pH e níveis de oxigênio dissolvido, de acordo com as necessidades específicas do estudo. Use uma rede para transferir suavemente os peixes de dourada juvenis para um recipiente temporário cheio de água do tanque. Depois de sacrificar o peixe, coloque um peixe de lado em uma bandeja de dissecação estéril. Com um bisturi, faça uma incisão cuidadosa ao longo da linha média ventral do peixe, da abertura em direção às brânquias. Use uma tesoura de dissecção para estender a incisão e expor os órgãos internos. Localize o rim da cabeça, que está situado logo atrás das brânquias perto da região dorsal anterior da cavidade corporal e se estende ao longo da parte superior abaixo da coluna vertebral. Com uma pinça e tesoura de ponta fina, limpe cuidadosamente os tecidos circundantes para visualizar melhor o rim da cabeça. Em seguida, levante o rim da cabeça e faça cortes precisos ao redor dele para libertá-lo dos tecidos circundantes. Coloque imediatamente o rim da cabeça excisado em um filtro de células posicionado dentro de uma placa de Petri estéril. Pipete dois mililitros de solução salina balanceada de Hanks, ou HBSS, em uma placa de Petri estéril. Macerar o rim da cabeça excisado no filtro de células usando o êmbolo de uma seringa para liberar as células na solução. Em seguida, prepare uma solução média de gradiente de densidade. Pipete 600 microlitros da solução média de gradiente de densidade em tubos de poliestireno de fundo redondo de cinco mililitros. Transfira lentamente dois mililitros de suspensão celular da placa de Petri para cada tubo. Centrifugue a 400g por 45 minutos a quatro graus Celsius com o freio desligado. Após centrifugação, remova o tubo e observe o anel leucocitário. Em seguida, use uma pipeta Pasteur estéril para transferir suavemente aproximadamente 100 microlitros do anel leucocitário para um tubo de microcentrífuga de dois mililitros. Agora, aumente o volume para dois mililitros com HBSS e ressuspenda suavemente as células. Centrifugue a amostra a 400g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Após centrifugação, descarte cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet no fundo do tubo. Em seguida, ressuspenda o pellet purificado em um mililitro de HBSS até que a concentração final da célula esteja entre 10.000 a um milhão de células por mililitro. Adicione 50 microlitros de dimetilsulfóxido a um frasco contendo o corante reativo. Depois de ajustar a densidade celular para um milhão de células por mililitro, transfira um mililitro da suspensão celular para tubos de microcentrífuga de dois mililitros. Preparar amostras de controlo de viabilidade conforme indicado. Induza a morte celular nos tubos três e quatro, colocando-os em banho-maria a 70 graus Celsius por sete minutos. Para corar as células, pipetar um microlitro do corante fluorescente reconstituído para os tubos dois e quatro contendo um mililitro de suspensão celular e misturar bem. Incube os tubos manchados em temperatura ambiente por 30 minutos, protegidos da luz. Em seguida, lave as células duas vezes com um mililitro de HBSS e ressuspenda o pellet final em 900 microlitros do mesmo tampão. Em seguida, pipete 100 microlitros de formaldeído a 37% para fixar as células e incube em temperatura ambiente por 15 minutos. Depois de lavar as células duas vezes com um mililitro de HBSS contendo 1% de BSA, ressuspender em um mililitro da mesma solução. Armazene as amostras a quatro graus Celsius na geladeira por até um mês. Coloque o tubo de amostra fixo na porta de amostra do citômetro de fluxo para análise. Registre um mínimo de 10.000 eventos para cada amostra dentro do portão de singlets. Salve todos os dados e faça backup em unidades externas ou armazenamento em nuvem. Visualize os dados de citometria de fluxo plotando a área de dispersão direta versus a área de dispersão lateral para avaliar o tamanho e a granularidade da célula. Execute o gating de célula singlete e exclua multipletos plotando a área de dispersão direta versus a altura de dispersão direta. Identifique as três populações de leucócitos com base nos perfis de dispersão direta versus lateral. Defina o limite para a coloração do corante de viabilidade no canal de fluorescência correspondente para distinguir células vivas e mortas. Em condições ideais, linfócitos, monócitos e granulócitos constituíram 31%, 38% e 31% da população de leucócitos, respectivamente, enquanto sob estresse térmico, os linfócitos diminuíram para 21,3%, os monócitos aumentaram para 45,6% e os granulócitos permaneceram estáveis em 33,1%. A amostra exposta às condições ótimas apresentou maior viabilidade, com predominância de células vivas em todas as populações de leucócitos. Em contraste, a amostra termicamente estressada mostrou um aumento significativo na morte celular.