Name: Um método simples de tubo de centrifugação dupla para obter plasma rico em plaquetas do sangue equino (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Aprenda um método simples de tubo de centrifugação dupla para obter plasma rico em plaquetas do sangue equino. Esta técnica acessível permite preparar PRP para tratamento de distúrbios musculoesqueléticos em cavalos com equipamentos básicos de laboratório.

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Este estudo foi conduzido de acordo com os protocolos internos para a preparação e uso de PRP em equinos no Hospital Veterinário Universitário da Universidad de Caldas, Manizales, Colômbia. Este estudo não necessitou de aprovação do Comitê Interno de Cuidados com Animais, pois os dados foram obtidos de cavalos mancos tratados clinicamente em nossa instituição. Dados de seis cavalos crioulos colombianos, três éguas e três castrados, com idade média de 7,4 (± 2,6) anos, foram usados para desenvolver este protocolo. Os proprietários dos cavalos foram informados sobre a natureza do estudo e assinaram um termo de consentimento livre e esclarecido. Todos os cavalos incluídos no estudo eram clinicamente saudáveis, exceto pelo problema musculoesquelético em tratamento. Foram incluídos apenas animais com contagem basal de plaquetas superior a 100 × 103/mL de sangue total. É importante ressaltar que cavalos com menores concentrações plaquetárias podem ser considerados trombocitopênicos14. Além disso, esses animais exibiram hemogramas, parâmetros bioquímicos clínicos hepáticos e renais normais e valores de análise de urina dentro da faixa normal para a espécie equina.
1. Restrição de cavalos e desinfecção da pele
<ol>
	<li>Para a segurança do cavalo e do veterinário, prenda o cavalo (Eqqus caballus) com segurança em uma rampa de exame clínico ou com um freio (Figura 1A), dependendo do comportamento do animal. Em seguida, corte uma área de cabelo de 5 cm x 5 cm com um barbeador elétrico no terço médio de um lado do pescoço, sobre a veia jugular. NOTA: Alguns proprietários preferem que o cavalo não seja tosquiado. Um estudo indica que o corte de cabelo no local da punção venosa não é necessário para evitar a contaminação bacteriana do P-PRP21. Portanto, este procedimento fica a critério do veterinário.</li>
	<li>Realize uma preparação preliminar da pele não estéril sobre a área cortada da veia jugular por pelo menos 10 cm usando gaze e luvas não estéreis por aproximadamente 3 min. Aplique vários pedaços de gaze embebidos em espuma antisséptica em um padrão circular (Figura 1B).</li>
	<li>Prepare o local da punção venosa assepticamente usando luvas estéreis e gaze embebida em desinfetante. Esfregue a pele na região do pescoço em movimentos circulares por aproximadamente 5 min. Limpe a área com gaze estéril embebida em álcool etílico a 95%.</li>
</ol>
2. Coleta de sangue asséptico
<ol>
	<li>Coloque 16 tubos de citrato de sódio de 4,5 mL, previamente limpos com gaze embebida em álcool etílico a 95%, em uma prateleira de plástico limpa. Impregnar as tampas de borracha dos tubos de vácuo com álcool etílico a 95%, especialmente no recesso para o acoplamento da agulha. NOTA: Em geral, são necessários oito tubos de citrato de sódio de 4,5 mL para obter 2,5 mL de PRP. O número de tubos usados em um caso particular dependerá dos tecidos moles ou da articulação específica a ser tratada.</li>
	<li>Insira estérilmente uma agulha borboleta no local jugular desinfetado (Figura 2A) e conecte tubos de citrato de sódio de 4,5 mL ao suporte (Figura 2B). Agite suavemente os tubos e coloque-os em uma prateleira de plástico. NOTA: Um tubo de citrato de sódio de 4,5 mL é usado para hemogramas automatizados e para preparar o plasma após centrifugação forte. Este plasma é então usado como um controle negativo para comparações de enriquecimento de fatores de crescimento e citocinas com o PRP.</li>
</ol>
3. Aquisição de plasma rico em plaquetas
<ol>
	<li>Coloque os tubos de citrato de sódio de 4,5 mL contendo sangue total em um rotor basculante de quatro lugares em um ângulo de 90° em uma centrífuga de bancada. Centrifugue os tubos a 120 × g por 5 min em temperatura ambiente. Após a centrifugação, posicione os tubos de 4,5 mL contendo sangue citrato e dois tubos lisos adicionais de 10 mL em um rack e coloque o rack no lado da mão não dominante do operador dentro de uma capela de fluxo laminar classe II sobre uma cortina estéril e impermeável. NOTA: Um estudo sugere que uma capela de fluxo laminar Classe II não é essencial para prevenir a contaminação bacteriana durante a aquisição de PRP21. Em vez disso, o PRP pode ser preparado em uma sala limpa, livre de correntes de ar e poeira. Nesse cenário, o suporte para tubos de sangue pode ser colocado em uma mesa coberta com uma cortina estéril e impermeável.</li>
	<li>Primeira centrifugação: Usando uma máscara facial e luvas estéreis, coloque uma seringa luer estéril de 10 mL acoplada a uma agulha estéril (21 G 5/8") no lado da mão dominante no interior da capela de fluxo laminar. NOTA: A partir deste momento, a mão enluvada dominante permanece sempre estéril, enquanto as tampas de borracha dos tubos de citrato de sódio devem ser removidas usando a mão não dominante enluvada.</li>
	<li>Insira a agulha estéril em cada tubo de sangue citrato centrifugado 3 mm sobre o revestimento leucocitário (Figura 3A) e aspire suavemente 50% da fração plasmática, evitando turbulência de fluido e aspiração de sangue. Uma vez aspirados 10 mL de plasma de quatro tubos de 4,5 mL, distribua-o em tubos simples estéreis de 5-10 mL (Figura 3B). NOTA: Remova as tampas de borracha desses tubos com a mão não dominante e coloque-as sobre um local estéril da cortina ou segure-as para evitar contaminação bacteriana.</li>
	<li>Segunda centrifugação: fechar novamente os tubos com as rolhas de borracha e colocá-los em equilíbrio num rotor basculante de quatro posições num ângulo de 90° na centrífuga de bancada e centrifugar estes tubos a 240 × g durante 5 min à temperatura ambiente. NOTA: A escolha da força de centrifugação relativa (RCF ou g) é baseada em um estudo seminal14 que descreveu pela primeira vez esse método para obter PRP do sangue equino. Além disso, esse método foi avaliado quanto à reprodutibilidade por outros autores22.</li>
	<li>Coloque os tubos em um rack e posicione-os no lado não dominante dentro da capela de fluxo laminar classe II, em cima do campo cirúrgico, estéril e impermeável previamente colocado.</li>
	<li>Use a mão não dominante para remover as tampas de borracha e a mão dominante estéril para aspirar lentamente os primeiros 75% do plasma usando uma agulha espinhal de 18 G, 90 mm conectada a uma seringa luer estéril de 10 mL (Figura 3C). Descarte esta seringa ou reserve-a para outros usos experimentais ou clínicos, pois contém plasma pobre em plaquetas (PPP). Em seguida, conecte a agulha espinhal estéril usada anteriormente a uma seringa luer estéril de 5 ou 10 mL para aspirar o plasma restante (25%) do tubo simples estéril de 5-10 mL. Essa fração é conhecida como P-PRP (Figura 3D). NOTA: Sob certas condições clínicas e experimentais, uma alíquota de 0,5-1 mL de PRP é usada para hemogramas automatizados seguidos de análise do fator de crescimento (TGF-β1 e PDGF-BB) por ensaio imunoenzimático. A medição desses mediadores pode ser realizada 3 h após a ativação do P-PRP com sais de cálcio ou trombina23 ou após a indução de dano celular por mudança de temperatura ou adição de detergentes não iônicos24.</li>
	<li>Enrole a seringa luer estéril contendo PRP em um pequeno campo estéril impermeável com uma agulha ou tampa estéril anexada para evitar a contaminação bacteriana do produto ortobiológico (Figura 4A). NOTA: A estrutura anatômica do cavalo a ser tratado deve ser preparada para injeção asséptica, conforme descrito na seção 1 deste protocolo. O cavalo deve ser adequadamente contido e sedado para minimizar o desconforto e garantir a segurança do cavalo e do veterinário. O produto PRP deve ser manuseado com luvas e agulhas estéreis e pode ou não ser ativado com base na preferência do profissional (Figura 4B).</li>
</ol>
4. Análise estatística
<ol>
	<li>Colete dados sobre contagens de plaquetas e leucócitos no sangue total e PRP. Avalie a normalidade dos dados usando o teste de Kolmogorov-Smirnov. Se os dados forem normalmente distribuídos (P &gt; 0,05), compare e analise os dados da célula usando o teste t. Se os dados de concentração de plaquetas e leucócitos não estiverem normalmente distribuídos (P &lt; 0,05), compare e analise os dados usando um teste de Wilcoxon.</li>
	<li>Determinar a concentração da eficiência plaquetária e leucocitária no P-PRP de acordo com as seguintes fórmulas25: Eficiência de coleta de plaquetas = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67985/67985eq01.jpg" style="margin: auto;"> × 100 Eficiência de coleta de leucócitos = <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67985/67985eq02.jpg" style="margin: auto;"> × 100</li>
	<li>Coletar dados das concentrações de TGF-β1 e PDGF-BB em sobrenadantes de PRP plasmáticos (controle negativo) (após 3 h de ativação com gluconato de cálcio) e lisados de PRP obtidos pela adição de uma solução de detergente não iônico.</li>
	<li>Use um modelo misto linear generalizado para comparar as concentrações de fator de crescimento entre plasma, sobrenadantes de PRP e lisado de PRP. Em caso de diferenças estatísticas significativas, aplicar um teste post-hoc de Tukey.</li>
	<li>Considerou-se p &lt; 0,05 valores estatisticamente significativos para todos os testes.</li>
</ol>

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<li>Carmona, J. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+effects+of+platelet-rich+gel+supernatants+on+histology+and+chondrocyte+apoptosis+scores%2C+hyaluronan+release+and+gene+expression+of+equine+cartilage+explants+challenged+with+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Vet+Res%22%5BJournal%5D)">In vitro effects of platelet-rich gel supernatants on histology and chondrocyte apoptosis scores, hyaluronan release and gene expression of equine cartilage explants challenged with lipopolysaccharide.</a> BMC Vet Res. 12 (1), 135(2016).</li>
<li>Castillo-Franz, C., López, C., Carmona, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+catabolic+and+anabolic+gene+expression+effects+and+histology+changes+induced+by+platelet-rich+gel+supernatants+in+equine+suspensory+ligament+explants+challenged+with+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22MLTJ-Muscles+Ligaments+and+Tendons%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the catabolic and anabolic gene expression effects and histology changes induced by platelet-rich gel supernatants in equine suspensory ligament explants challenged with lipopolysaccharide.</a> MLTJ-Muscles Ligaments and Tendons. 11 (1), 1-14 (2021).</li>
<li>Argüelles, D., Carmona, J. U., Climent, F., Muñoz, E., Prades, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+platelet+concentrates+as+a+treatment+for+musculoskeletal+lesions+in+five+horses%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Rec%22%5BJournal%5D)">Autologous platelet concentrates as a treatment for musculoskeletal lesions in five horses.</a> Vet Rec. 162 (7), 208-211 (2008).</li>
<li>Carmona, J. U., Argüelles, D., Climent, F., Prades, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+platelet+concentrates+as+a+treatment+of+horses+with+osteoarthritis%3A+a+preliminary+pilot+clinical+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Equine+Vet+Sci%22%5BJournal%5D)">Autologous platelet concentrates as a treatment of horses with osteoarthritis: a preliminary pilot clinical study.</a> J Equine Vet Sci. 27 (4), 167-170 (2007).</li>
<li>Dejnek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Content+of+blood+cell+components%2C+inflammatory+cytokines+and+growth+factors+in+autologous+platelet-rich+plasma+obtained+by+various+methods%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Orthop%22%5BJournal%5D)">Content of blood cell components, inflammatory cytokines and growth factors in autologous platelet-rich plasma obtained by various methods.</a> World J Orthop. 13 (6), 587-602 (2022).</li>
<li>Giraldo, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+breed%2C+sex+and+age+on+cellular+content+and+growth+factor+release+from+equine+pure-platelet+rich+plasma+and+pure-platelet+rich+gel%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Vet+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of the breed, sex and age on cellular content and growth factor release from equine pure-platelet rich plasma and pure-platelet rich gel.</a> BMC Vet Res. 9, 29(2013).</li>
<li>Zimmermann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preparation+technique+and+white+cell+content+influence+the+detectable+levels+of+growth+factors+in+platelet+concentrates%5BTitle%5D)+AND+%22Vox+Sang%22%5BJournal%5D)">Sample preparation technique and white cell content influence the detectable levels of growth factors in platelet concentrates.</a> Vox Sang. 85 (4), 283-289 (2003).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Tubos de coleta de sangue venoso simples de 10 mL&nbsp;</td><td>BD Vacutainer, Franklin Lakes, NJ, EUA</td><td>Referência 366430</td><td>Este é apenas um exemplo, tubos de outras marcas podem ser usados.</td></tr><tr><td>Tubos de citrato de sódio de 4,5 mL (105 M/3,2%)&nbsp;</td><td>BD Vacutainer, Franklin Lakes, NJ, EUA</td><td>107451</td><td>Este é apenas um exemplo, tubos de outras marcas podem ser usados.</td></tr><tr><td>Centrífuga de bancada</td><td>Rotofix 32A, Hettich GmbH, Tuttlingen, Alemanha</td><td></td><td>Outras centrífugas de bancada podem ser usadas.</td></tr><tr><td>Agulha borboleta (21 G &vezes; 0,75 pol.) com 12 pol. tubo e suporte pré-anexado&nbsp;</td><td>Conjunto de Coleta de Sangue Safety-Lok, BD Vacutainer, Franklin Lakes, NJ, EUA</td><td>Referência 367296</td><td>Este é apenas um exemplo, agulhas borboleta de outras marcas podem ser usadas.</td></tr><tr><td>Solução de espuma de clorexidina a 2,3-4%&nbsp;</td><td></td><td></td><td>A marca ou os nomes comerciais desses produtos podem variar de país para país.</td></tr><tr><td>Capela-circuito de fluxo laminar Classe II</td><td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, EUA</td><td></td><td>Outras capas de fluxo laminar classe II podem ser usadas</td></tr><tr><td>Leitor ELISA</td><td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Álcool etílico a 95%</td><td></td><td></td><td>A marca ou os nomes comerciais desses produtos podem variar de país para país.</td></tr><tr><td>Humano PDGF-BB DuoSet ELISA</td><td>R& D Systems, Inc, McKinley Place, MN, EUA</td><td>DY220</td><td></td></tr><tr><td>DouSet ELISA de TGF-beta 1 humano</td><td>R& D Systems, Inc, McKinley Place, MN, EUA</td><td>DY240</td><td></td></tr><tr><td>Solução de espuma de iodopovidona a 4-10%&nbsp;</td><td></td><td></td><td>A marca ou os nomes comerciais desses produtos podem variar de país para país.</td></tr><tr><td>Software SPSS 25.0</td><td>IBM Corp, SPSS, NY, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringas luer estéreis de vários volumes&nbsp;</td><td>Seringa Discardit, BD Vacutainer, Franklin Lakes, NJ, EUA</td><td></td><td>Este é apenas um exemplo, seringas de outras marcas podem ser usadas.</td></tr><tr><td>Agulha espinhal estéril (18 G &vezes; 90 mm)&nbsp;</td><td>Agulha de Espinélio BD Quincke, Franklin Lakes, NJ, EUA</td><td></td><td>Este é apenas um exemplo, agulhas espinhais de outras marcas podem ser usadas.</td></tr></tbody></table>

um método simples de tubo de centrifugação dupla para obter plasma rico em plaquetas do sangue equino

A Simple Double Centrifugation Tube Method to Obtain Platelet-rich Plasma from Equine Blood

A contagem média de plaquetas (plaquetas × 103/μL) foi significativamente maior no PRP do que no sangue total (p &lt; 0,001). Em contraste, a concentração média de leucócitos (leucócitos × 103/μL) no PRP foi significativamente menor do que no sangue total (p &lt; 0,001) (Tabela 1). Especificamente, a contagem de plaquetas no PRP foi 2,41 vezes maior do que no sangue total, enquanto a concentração de leucócitos no PRP foi 0,44 vezes menor. A eficiência de coleta de PLT no PRP foi de ...

Um método simples de tubo de centrifugação dupla para obter plasma rico em plaquetas do sangue equino

Platelet-rich plasma (PRP) is widely utilized as a routine treatment for chronic musculoskeletal conditions in horses, such as osteoarthritis, ...

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JoVE Journal

Medicine

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Lisado de plaquetas humanas é uma fonte rica em fatores de crescimento e um suplemento potente em cultura de células. Este protocolo apresenta o processo de preparação de um grande pool de lisado de plaquetas humanas por a partir de plasma rico em plaquetas, realizando diversos ciclos de congelamento e descongelamento e esgotando os fragmentos de plaquetas.

Preparação de pool de plaquetas Lysate Humanos (pHPL) como um suplemento eficiente para animais de soro livre de culturas de células estaminais humanas

Este vídeo demonstra a preparação de plasma rico em plaquetas (PRP) de alta qualidade por meio da triagem da contagem de plaquetas, coleta e centrifugação de sangue e isolamento de plaquetas. Este PRP é usado em aplicações terapêuticas para regeneração e cicatrização de tecidos.

Preparação de plasma rico em plaquetas a partir de sangue periférico humano

Descrevemos uma metodologia para o processamento de sangue total para obter uma variedade de componentes para análise posterior. Otimizamos um protocolo simplificado que permite o processamento simultâneo rápido e de alto rendimento de amostras de sangue total em um ambiente não clínico.

Fracionamento rápido e isolamento de componentes de sangue total em amostras obtidas a partir de uma configuração de base comunitária

A Fibrina Rica em Plaquetas Leucocitárias (L-PRF) representa uma preparação aprovada pela FDA de concentrados de plaquetas autólogos que possui arquitetura única de fibrina, plaquetas enriquecidas e fatores de crescimento abundantes. Aqui, apresentamos um protocolo para geração de L-PRF em consultório, bem como avaliamos suas propriedades mecânicas, incluindo testes uniaxiais e testes de resistência à retenção de sutura.

Caracterização de leucócito-rico em plaquetas de fibrina, A Novel Biomaterial

Descreve-se um método simples para o isolamento de plaquetas lavadas a partir de sangue humano seguido por meio de medições de agregação plaquetária induzida por agonistas por turbidimetria. Como exemplo, aplicam-se este método para estudar a resposta de agregação de plaquetas humanas a colagénio depois de uma pré-incubação com o inibidor do canal Pannexin1 Brilliant Blue FCF.

Turbidimetria em plaquetas humanas lavadas: O efeito do inibidor Pannexin1-Brilliant Blue FCF na agregação induzida por colagénio

Neste trabalho, descrevemos um método para avaliar endotelial von Willebrand fator liberação e as plaquetas subsequentes capturam sob tensão de cisalhamento de fluido em resposta a estímulos inflamatórios, usando um sistema de câmara de fluxo em vitro .

Investigando a von Willebrand Factor fisiopatologia usando um modelo de câmara de fluxo de von Willebrand Factor-plaquetas String formação

Aqui, o sangue do rato foi coletado na presença de um anticoagulante. As plaquetas foram purificadas por meio de gradiente iohexol utilizando centrifugação de baixa velocidade. As plaquetas foram ativadas com trombina para investigar se eram viáveis. A qualidade das plaquetas purificadas foi analisada por citometria de fluxo e microscopia.

Purificação de plaquetas de sangue de rato

Este protocolo detalha a preparação clinicamente implementável de biosamples de PBMC e plasma de alta qualidade no local do ensaio clínico que pode ser usado para análise de biomarcadores translacionais.

Preparação de pelotas de células mononucleares de sangue periférico e plasma de uma única coleta de sangue em locais de ensaio clínico para análise de biomarcadores

A formação de plaquetas pró-coagulantes tem sido correlacionada com um risco aumentado de trombose. Apresenta-se aqui um protocolo preciso para isolar plaquetas lavadas do sangue humano, destinado a quantificar a exposição à fosfatidilserina e a liberação de microvesículas, que são características distintivas das plaquetas pró-coagulantes.

Caracterização de plaquetas pró-coagulantes medindo a exposição à fosfatidilserina e a liberação de microvesículas de plaquetas purificadas humanas

O metabolismo plaquetário é de interesse, particularmente no que se refere ao papel da hiper e hipoatividade plaquetária no sangramento e distúrbios trombóticos. O isolamento de plaquetas do plasma é necessário para alguns ensaios metabólicos; Apresentamos aqui um método para isolamento de metabólitos intracelulares de plaquetas lavadas.

Preparação de plaquetas humanas lavadas para estudos quantitativos de fluxo metabólico

Aprenda um método simples de tubo de centrifugação dupla para obter plasma rico em plaquetas do sangue equino. Esta técnica acessível permite preparar PRP para tratamento de distúrbios musculoesqueléticos em cavalos com equipamentos básicos de laboratório.

Um método simples de tubo de centrifugação dupla para obter plasma rico em plaquetas do sangue equino

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