Name: Tratamento de ilhotas pancreáticas isoladas e medição de apoptose (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T13:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Aprenda a tratar ilhotas pancreáticas isoladas e medir apoptose usando microscopia confocal de fluorescência em ilhotas de camundongo. Este método ajuda pesquisadores a estudar morte celular induzida por citocinas no diabetes tipo 1.

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<ol><li>Da Silva Xavier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cells+of+the+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clinical+medicine%22%5BJournal%5D)">The cells of the islets of Langerhans.</a> J Clinical medicine. 7 (3), 54(2018).</li>
<li>Grunnet, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proinflammatory+cytokines+activate+the+intrinsic+apoptotic+pathway+in+%CE%B2-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Proinflammatory cytokines activate the intrinsic apoptotic pathway in β-cells.</a> Diabetes. 58 (8), 1807-1815 (2009).</li>
<li>Delaney, C. A., Pavlovic, D., Hoorens, A., Pipeleers, D. G., Eizirik, D. cL. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokines+induce+deoxyribonucleic+acid+strand+breaks+and+apoptosis+in+human+pancreatic+islet+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Cytokines induce deoxyribonucleic acid strand breaks and apoptosis in human pancreatic islet cells.</a> Endocrinology. 138 (6), 2610-2614 (1997).</li>
<li>Farnsworth, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+gap+junction+coupling+within+the+islet+of+langerhans+during+the+development+of+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Modulation of gap junction coupling within the islet of langerhans during the development of type 1 diabetes.</a> Front Physiol. 13, 913611(2022).</li>
<li>Collins, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+protein+kinase+c+%CE%B4+by+caspase-3+mediates+proinflammatory+cytokine-induced+apoptosis+in+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cleavage of protein kinase c δ by caspase-3 mediates proinflammatory cytokine-induced apoptosis in pancreatic islets.</a> J Biol Chem. 300 (9), 107611(2024).</li>
<li>Farnsworth, N. L., Walter, R., Piscopio, R. A., Schleicher, W. E., Benninger, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exendin-4+overcomes+cytokine-induced+decreases+in+gap+junction+coupling+via+protein+kinase+A+and+Epac2+in+mouse+and+human+islets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Exendin-4 overcomes cytokine-induced decreases in gap junction coupling via protein kinase A and Epac2 in mouse and human islets.</a> J Physiol. 597 (2), 431-447 (2019).</li>
<li>NIH CIT Consortium Chemistry Manufacturing Controls Monitoring Committee. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purified+human+pancreatic+islet-viability+estimation+of+islet+using+fluorescent+dyes+%28FDA%2FPI%29%3A+Standard+operating+procedure+of+the+NIH+clinical+islet+transplantation+consortium%5BTitle%5D)+AND+%22CellR4+Repair+Replace+Regen+Reprogram%22%5BJournal%5D)">Purified human pancreatic islet-viability estimation of islet using fluorescent dyes (FDA/PI): Standard operating procedure of the NIH clinical islet transplantation consortium.</a> CellR4 Repair Replace Regen Reprogram. 3 (1), e1378(2015).</li>
<li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutellingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+for+apoptosis+flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labelled+annexin+V%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Meth%22%5BJournal%5D)">A novel assay for apoptosis flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled annexin V.</a> J Immunol Meth. 184 (1), 39-51 (1995).</li>
<li>Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+annexin+V%2Fpropidium+iodide+apoptosis+assay+for+accurate+assessment+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Modified annexin V/propidium iodide apoptosis assay for accurate assessment of cell death.</a> J Vis Exp. (50), e2597(2011).</li>
<li>Emdin, S., Dodson, G., Cutfield, J., Cutfield, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+zinc+in+insulin+biosynthesis%3A+some+possible+zinc-insulin+interactions+in+the+pancreatic+B-cell%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Role of zinc in insulin biosynthesis: some possible zinc-insulin interactions in the pancreatic B-cell.</a> Diabetologia. 19, 174-182 (1980).</li>
<li>ZA, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+staining+fresh+and+cultured+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">A simple method of staining fresh and cultured islets.</a> Transplantation. 45 (4), 827-830 (1988).</li>
<li>Zalewski, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video+image+analysis+of+labile+zinc+in+viable+pancreatic+islet+cells+using+a+specific+fluorescent+probe+for+zinc%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Video image analysis of labile zinc in viable pancreatic islet cells using a specific fluorescent probe for zinc.</a> J Histochem Cytochem. 42 (7), 877-884 (1994).</li>
<li>Jindal, R. M., Taylor, R. P., Gray, D. W., Esmeraldo, R., Morris, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+quantification+of+islets+by+measurement+of+zinc+content%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">A new method for quantification of islets by measurement of zinc content.</a> Diabetes. 41 (9), 1056-1062 (1992).</li>
<li>Jayaraman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+the+detection+of+viable+human+pancreatic+beta+cells+by+flow+cytometry+using+fluorophores+that+selectively+detect+labile+zinc%2C+mitochondrial+membrane+potential+and+protein+thiols%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">A novel method for the detection of viable human pancreatic beta cells by flow cytometry using fluorophores that selectively detect labile zinc, mitochondrial membrane potential and protein thiols.</a> Cytometry A. 73 (7), 615-625 (2008).</li>
<li>Lukowiak, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+purification+of+functional+human+%CE%B2-cells+by+a+new+specific+zinc-fluorescent+probe%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Identification and purification of functional human β-cells by a new specific zinc-fluorescent probe.</a> J Histochem Cytochem. 49 (4), 519-527 (2001).</li>
<li>Gee, K. R., Zhou, Z. L., Qian, W. J., Kennedy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+imaging+of+zinc+secretion+from+pancreatic+%CE%B2-cells+using+a+new+fluorescent+zinc+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Detection and imaging of zinc secretion from pancreatic β-cells using a new fluorescent zinc indicator.</a> J Am Chem Soc. 124 (5), 776-778 (2002).</li>
<li>Gyulkhandanyan, A. V., Lee, S. C., Bikopoulos, G., Dai, F., Wheeler, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Zn2%2B-transporting+pathways+in+pancreatic+%CE%B2-cells%3A+a+role+for+the+L-type+voltage-gated+Ca2%2B+channel%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The Zn2+-transporting pathways in pancreatic β-cells: a role for the L-type voltage-gated Ca2+ channel.</a> J Biol Chem. 281 (14), 9361-9372 (2006).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+pancreatic+islet+cell-based+screening+for+diabetogenic+environmental+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A murine pancreatic islet cell-based screening for diabetogenic environmental chemicals.</a> J Vis Exp. (136), e57327(2018).</li>
<li>Farnsworth, N. L., Walter, R. L., Hemmati, A., Westacott, M. J., Benninger, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+level+pro-inflammatory+cytokines+decrease+connexin36+gap+junction+coupling+in+mouse+and+human+islets+through+nitric+oxide-mediated+protein+kinase+C%CE%B4%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Low level pro-inflammatory cytokines decrease connexin36 gap junction coupling in mouse and human islets through nitric oxide-mediated protein kinase Cδ.</a> J Biol Chem. 291 (7), 3184-3196 (2016).</li>
<li>Dalle, S., Abderrahmani, A., Renard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+inhibitors+of+%CE%B2-cell+dysfunction+and+death+as+therapeutics+for+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Pharmacological inhibitors of β-cell dysfunction and death as therapeutics for diabetes.</a> Front Endocrinol. 14, 1076343(2023).</li>
<li>Collins, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide-coated+polycaprolactone-Benzalkonium+chloride+nanocapsules+for+targeted+drug+delivery+to+the+pancreatic+%CE%B2-Cell%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Bio+Mater%22%5BJournal%5D)">Peptide-coated polycaprolactone-Benzalkonium chloride nanocapsules for targeted drug delivery to the pancreatic β-Cell.</a> ACS Appl Bio Mater. 7 (10), 6451-6466 (2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Placa de Petri com fundo de vidro de 14 mm</td><td>Mattek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>1640 RPMI</td><td>Corning</td><td>10-041-CV</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de 35 mm</td><td>Celltreat</td><td>229638</td><td></td></tr><tr><td>placa de Petri com fundo de vidro de 7 mm</td><td>Mattek</td><td>P35G-1.5-7-C</td><td></td></tr><tr><td>Anexina V, Alexa Flour 488</td><td>Thermo Fisher (Invitrogen)</td><td>A13201</td><td>ex488/em515</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio di-hidratado</td><td>Fisher</td><td>C79</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sulfóxido anidro</td><td>Sigma</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>soro bovino fetal</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Flouzin-3, AM</td><td>Thermo Fisher (Invitrogen)</td><td>F24195</td><td>ex488/em516</td></tr><tr><td>Diacetato de fluoresceína (FDA)</td><td>Thermo Fisher (Invitrogen)</td><td>F1303</td><td>ex488/em520</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>54457</td><td></td></tr><tr><td>Software de processamento de imagem</td><td>NIH</td><td>ImageJ</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342)</td><td>Thermo Fisher (Invitrogen)</td><td>R37605</td><td>ex360/em460</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>15-140-122&nbsp;</td><td></td></tr> Cloreto de potássio <tr><td>Fisher</td><td>BP2944-100</td><td></td>das <td>tabuletas salinas Fosfato-tamponadas</td></tr><tr><td>, iodeto granulado</td> Thermo Fisher do propídio de <td>Macron</td><td>6858-04</td><td></td></tr><tr><td></td><td>(Invitrogen</td> <td>P1304MP</td> proteína recombinante R& do rato IFN-gama da proteína <td>ex535/em620</td></tr><tr><td></td><td> D Systems</td><td>485-MI-100/CF</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Recombinante IL-1 beta/IL-1F2&nbsp;</td><td>R& D Systems</td><td>401-ML-100/CF</td><td></td></tr><tr><td>Camundongo Recombinante TNF-alfa (aa 80-235) Proteína</td><td>R& D Systems</td><td>410-MT-100/CF</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Sódio, Cristal</td><td>Macron</td><td>7581-12</td><td></td></tr><tr><td>Stellaris Microcope Confocal com Detectores Espectrais</td><td>Leica</td><td>DMI-8</td><td>; Objetiva de imersão em água 40x.</td></tr><tr><td>Yopro-1 iodeto</td><td>Thermo Fisher (Invitrogen)</td> <td>Y3603</td><td>ex488 / em509</td></tr></tbody></table>

tratamento de ilhotas pancreáticas isoladas e medição de apoptose

Isolated Pancreatic Islet Treatment and Apoptosis Measurement

A coloração dupla com FDA e PI foi utilizada para avaliar a viabilidade de ilhotas tratadas com citocinas. Todos os experimentos foram conduzidos em triplicata (n = 3), e os dados foram gerados a partir de várias imagens z-stack de 10 μm de distância, com cada réplica contendo dados médios de 5 ou 6 ilhotas, para garantir a reprodutibilidade e comparação estatística entre as ilhotas tratadas e não tratadas. A Figura 1A mostra ilhotas saudáveis do grupo de controle não tratado exibindo fluore...

Tratamento de ilhotas pancreáticas isoladas e medição de apoptose

This study investigates the effect of pro-inflammatory cytokines on pancreatic islets, particularly insulin-producing &#946;-cells, using a combination of ...

isolated-pancreatic-islet-treatment-and-apoptosis-measurement

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Alcançar alta qualidade e quantidade adequada de ilhotas humanas é um dos pré-requisitos importantes para o transplante de ilhotas bem sucedido. Neste vídeo, descrevemos passo a passo os procedimentos para o isolamento de ilhotas pancreáticas humanas (parte II: purificação e cultura de ilhotas humanas) utilizando um método modificado automatizado.

Isolamento Islet humana Pancreatic: Parte II: Purificação e Cultura de Ilhotas Humanos

O fornecimento de diabéticos tipo 2 ilhotas para pesquisa é insuficiente. Aqui nós compartilhamos nosso protocolo para isolar ilhotas de pacientes submetidos à pancreatectomia parcial. Esta abordagem representa um local único para a obtenção de ilhotas de diabéticos tipo 2 e clinicamente combinado não-diabéticos em número adequado para estudos básicos e clínicos.

Isolamento de Ilhotas Humanos de pacientes parcialmente pancreatectomizado

As ilhotas pancreáticas, também chamadas de ilhotas de Langerhans, são um aglomerado de células endócrinas que produzem hormônios para a regulação da glicose e outras funções biológicas importantes. Este protocolo explica um método para isolar ilhotas pancreáticas pela primeira vez perfundindo colagenase via ampola de Vater para digerir o tecido pancreático exócrino e uma centrifugação simplificada com gradiente de densidade para purificar as ilhotas de camundongos.

Isolamento de ilhotas pancreáticas por meio de perfusão de colagenase: um método enzimático para isolar células de ilhotas pancreáticas

Ensaiando in vitro a função das células β usando o mouse ilhotas isoladas de Langerhans é um componente importante no estudo da fisiopatologia do diabetes e terapêutica. Embora muitas aplicações a jusante estão disponíveis, este protocolo descreve especificamente a medida da intracelular monofosfato cíclico de adenosina (AMPc) como um parâmetro essencial para definir a função das células β.

Um Método para Mouse ilhotas pancreáticas Isolamento e intracelular cAMP Determinação

desafios críticos para o campo de pesquisa do diabetes estão a compreender os mecanismos moleculares que regulam a replicação de células β dos ilhéus e desenvolver métodos para estimular a regeneração de células-β. Aqui um método de alto teor de rastreio para identificar e avaliar a actividade de promoção da replicação de células β de moléculas pequenas é apresentada.

A-alta conteúdo<em&gt; In Vitro</em&gt; Replicação plataforma de descoberta de células-β das ilhotas pancreáticas

Este protocolo esboça um método para a análise quantitativa da formação complexa da proteína do mitofagia especificamente em pilhas beta das amostras preliminares do Islet humano. Esta técnica permite assim a análise da mitofagia do material biológico limitado, que são cruciais em amostras pancreatic humanas preciosas da pilha beta.

Visualização de complexos de Mitophagy endógenos in situ em células beta pancreáticas humanas utilizando o ensaio de ligadura de proximidade

Aqui, nós apresentamos um protocolo para gerar de alta qualidade, dados do transcriptoma em grande escala das únicas pilhas das ilhotas pancreatic humanas isoladas usando uma tecnologia de sequenciamento microfluídico do RNA da único-pilha da gota-baseada.

Sequenciamento de RNA de célula única e análise de ilhotas pancreáticas humanas

Este protocolo fornece um guia passo a passo para a aquisição de um pâncreas suíno para isolamento e purificação de ilhotas.

Perfusão Cirúrgica e Isolamento do Pâncreas Suíno para Isolamento de Ilhotas

Aqui, fornecemos detalhes sobre a realização da secreção de insulina estimulada por glicose (GSIS) via perfusão através da vasculatura de camundongos com um pâncreas intacto como uma técnica adicional para avaliar a função pancreática endócrina com redução de possíveis fatores de confusão.

Secreção de insulina estimulada por glicose via perfusão através da vasculatura de camundongos com pâncreas intacto

Este protocolo descreve um método padronizado para colheita cirúrgica, digestão enzimática e purificação por gradiente de densidade de ilhéus pancreáticos de rato Lewis, permitindo preparações de alto rendimento e alta pureza para uso direto em transplantes ou estudos in vitro .

Isolamento e purificação de ilhotas pancreáticas a partir de ratos Lewis usando digestão enzimática e separação por gradiente de densidade

Aprenda a tratar ilhotas pancreáticas isoladas e medir apoptose usando microscopia confocal de fluorescência em ilhotas de camundongo. Este método ajuda pesquisadores a estudar morte celular induzida por citocinas no diabetes tipo 1.

Tratamento de ilhotas pancreáticas isoladas e medição de apoptose

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