Tratamento de ilhotas pancreáticas isoladas e medição de apoptose

Este estudo utiliza marcadores de morte celular e apoptose baseados em fluorescência multicoloração combinados com microscopia confocal para avaliar a apoptose induzida por citocinas e a morte específica de β células em ilhotas pancreáticas. Revela mudanças espaciais e temporais na morte celular e apoptose em resposta a estímulos extracelulares.

Minha pesquisa está focada em entender os fatores que levam ao desenvolvimento e progressão do diabetes tipo um e projetar novas terapias para fornecer opções de tratamento para pacientes com DM1. Nosso laboratório usa biomateriais projetados como uma ferramenta para estudar o diabetes tipo um em tecidos humanos e desenvolver terapias personalizadas de administração de medicamentos para cada estágio do DM1. Nosso protocolo fornece informações detalhadas sobre os mecanismos e a localização espacial da morte celular em ilhotas intactas que nos ajudam a entender melhor as causas da morte das ilhotas no DM1.

[Narrador] Para começar, obtenha ilhotas de camundongos e, usando uma micropipeta de 10 microlitros, isole-as no meio de cultura. Incube durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono para permitir a recuperação do estresse de isolamento antes do tratamento com citocinas. Adicione dois mililitros de meio de cultura de ilhotas esterilizado a placas de Petri tratadas com cultura não tecidual de 35 milímetros. Rotule os pratos adequadamente para diferenciar os pratos tratados com citocinas dos não tratados. Para placas tratadas com citocinas, remova seis microlitros de meio de cultura. Substitua por dois microlitros de cada citocina da solução estoque para atingir a concentração final desejada. De 12 a 24 horas após o isolamento, pegue de 10 a 20 ilhotas usando uma micropipeta sob um microscópio óptico. Transfira as ilhotas para os pratos preparados e incube em uma incubadora umidificada de dióxido de carbono a 37 graus Celsius a 5% por 24 horas. Para realizar a medição da viabilidade das ilhotas usando FDA e PI, adicione 20 microlitros de soluções estoque FDA e PI cada a 960 microlitros de tampão BMHH contendo 0,1% de albumina de soro bovino. Alíquota de 100 microlitros da solução de coloração em uma placa de Petri tratada com cultura sem tecido com fundo de vidro de sete milímetros. 24 horas após a incubação com citaocinas, transferir cuidadosamente pelo menos seis ilhotas de cada tratamento para a placa de Petri com fundo de vidro. Incube as ilhotas por cinco a 10 minutos em temperatura ambiente no escuro, cobrindo o prato com papel alumínio. Capture imagens usando microscopia de fluorescência com uma objetiva de imersão em água de 40x. Adquira imagens dentro de 15 minutos após a coloração de diacetato de fluoresceína e iodeto de propídio. Para medição de apoptose usando coloração, primeiro adicione oito microlitros de YOPRO-1 de uma solução estoque de um milimolar a 992 microlitros de tampão de imagem BMHH. Alíquota de cinco 500 microlitros da solução de coloração em uma placa de Petri tratada com cultura com fundo de vidro de 14 milímetros, sem tecido. Às 24 horas após a incubação com citocinas, transferir cuidadosamente pelo menos seis ilhotas de cada tratamento para a placa de Petri com fundo de vidro. Incube as ilhotas por uma hora a 37 graus Celsius no escuro, cobrindo o prato com papel alumínio. Após 20 minutos de incubação, adicione 20 microlitros de mancha nuclear NucBlue a cada placa de Petri com fundo de vidro. Continue a incubação para atingir um tempo total de incubação de uma hora para YOPRO-1 e 40 minutos para a coloração nuclear. Em seguida, transfira as ilhotas para um Petri de sete milímetros, sem tecido, tratado com cultura, com 100 microlitros de tampão de imagem BMHH fresco contendo 0,1% de BSA. Capture imagens usando microscopia de fluorescência com uma objetiva de imersão em água de 40x. Use lasers de excitação em comprimentos de onda especificados para detectar emissões de fluorescência dos corantes. Adicione duas gotas ou 40 microlitros de corante nuclear a um mililitro de tampão de ligação de anexina. Alíquota de 100 microlitros da solução em uma placa de Petri tratada com cultura com fundo de vidro de sete milímetros, sem tecido. Após 24 horas após a incubação com citocinas, usando uma micropipeta de 10 microlitros, enxágue cuidadosamente pelo menos seis ilhotas de cada tratamento em PBS, pipetando para cima e para baixo três vezes. Transfira as ilhotas para a placa de Petri com fundo de vidro contendo a solução de coloração nuclear e incube por 40 minutos a 37 graus Celsius no escuro, cobrindo a placa com papel alumínio. Após 25 minutos de incubação, adicione cinco microlitros de conjugado Anexin V Alexa Fluor 488 a cada placa de Petri com fundo de vidro. Continue a incubação para atingir um tempo total de incubação de 40 minutos para a mancha nuclear e 15 minutos para a Anexina V. Após 40 minutos de incubação, transfira as ilhotas para um tampão de imagem BMHH fresco sem anexina V ou coloração nuclear em uma placa de Petri com fundo de vidro de sete milímetros. Capture imagens com microscopia de fluorescência usando uma objetiva de imersão em água de 40x e lasers de excitação em comprimentos de onda especificados. Adicione dois microlitros de solução estoque AM indicadora seletiva de íons de zinco a 998 microlitros de tampão de imagem BMHH até uma concentração final de 0,2 micromolar. Alíquota de 500 microlitros da solução de coloração em uma placa de Petri tratada com cultura com fundo de vidro de 14 milímetros, sem tecido. Às 24 horas após a incubação com citocinas, transferir cuidadosamente pelo menos seis ilhotas de cada tratamento para a placa de Petri com fundo de vidro. Incube por uma hora a 37 graus Celsius no escuro, cobrindo o prato com papel alumínio. Após 20 minutos de incubação, adicione 20 microlitros de corante nuclear a cada placa de Petri e continue a incubação conforme mencionado. Em seguida, transfira as ilhotas para um Petri de sete milímetros, sem tecido, tratado com cultura, com 100 microlitros de tampão de imagem BMHH fresco contendo 0,1% de BSA. Adicione dois microlitros de solução estoque de PI para atingir uma concentração final de 20 microgramas por mililitro e incube por 10 minutos. Capture imagens dentro de 15 minutos após a coloração com iodeto de propídio usando microscopia de fluorescência com uma objetiva de imersão em água de 40x e lasers de excitação em comprimentos de onda especificados. Após a coloração dupla com FDA e PI, as ilhotas saudáveis do grupo controle não tratado exibiram forte fluorescência verde, indicando alta viabilidade com membranas celulares intactas. As ilhotas tratadas com citocinas exibiram fluorescência vermelha proeminente, significando aumento da morte celular devido ao comprometimento da integridade da membrana. Um aumento dependente da dose na morte de células das ilhotas foi observado com o aumento das concentrações de citocinas, com maior exposição levando ao aumento da fluorescência vermelha. Após YOPRO-1 e coloração nuclear, as ilhotas não tratadas apresentaram forte fluorescência nuclear azul sem coloração verde, confirmando a presença de células não apoptóticas viáveis. As ilhotas tratadas com citocinas exibiram fluorescência verde de YOPRO-1 ao lado de coloração nuclear azul, indicando células apoptóticas. A análise quantitativa mostrou que mais de 30% das ilhotas pancreáticas sofreram apoptose dentro de 24 horas após a exposição às citocinas. A coloração com anexina V também confirmou a apoptose, com aproximadamente 40% das ilhotas apresentando coloração positiva para células apoptóticas precoces e progressivas. O indicador seletivo de zinco mostrou discreta coloração pontilhada em ilhotas não tratadas, indicando ligação ao zinco associada à insulina em grânulos secretores. As ilhotas tratadas com citocinas exibiram fluorescência vermelha e azul adicional, permitindo a visualização precisa da morte das células beta. Dados quantitativos revelaram que as citocinas destruíram aproximadamente 63% das células beta produtoras de insulina em 24 horas após a exposição.