Um protocolo de citometria de eletroporação para microscopia de fluorescência de células vivas usando cultura de células U2 OS

O escopo desta pesquisa se concentra no efeito dos campos elétricos pulsados no comportamento celular, particularmente como a eletroporação afeta o ciclo celular.

A principal vantagem deste protocolo é a capacidade de realizar experimentos contínuos de eletroporação de células vivas usando cultura de células de mamíferos por até 72 horas. Nosso laboratório está focado em adaptar essas técnicas para microfluídica, o que permitirá tamanhos de amostra mais baixos, requisitos reduzidos de reagentes e melhor controle de amostras para protocolos futuros.

[Narrador] Para começar, cultive células U2OS FUCCI CA5 em uma placa de 10 centímetros com 10 mililitros de DMEM de alta glicose contendo 10% de FBS e 1% de estreptomicina de penicilina. Incube a placa a 37 graus Celsius em um ambiente de 5% de dióxido de carbono. Quando a cultura atingir 80% de confluência, aspirar o meio da placa. Lave as células com PBS, adicione um mililitro de tripsina a 0,25% e incube por 1,5 minutos para dissociar as células. Neutralize a tripsina ressuspendendo as células dissociadas em cinco mililitros de glicose alta de DMEM. Obter uma amostra de 100 microlitros da cultura ressuspensa e colocá-la na lamínula de vidro inferior dentro da câmara do sistema de citometria por electroporação. Certifique-se de que a câmara esteja 30% confluente após a introdução da amostra. Adicione lentamente quatro mililitros de glicose alta de DMEM na extremidade da câmara, evitando que o líquido saia da amostra. Coloque uma lâmina de microscópio padrão sobre a câmara e incube a câmara a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 24 horas. Ligue o microscópio fluorescente invertido com uma câmara de controle ambiental para permitir que o sistema se estabilize antes da eletroporação. Enquanto a câmara ambiental estiver se estabilizando, use cabos de garra jacaré para conectar um multímetro digital ao capacitor do gerador de pulso e ao interruptor de alta tensão para uma configuração rápida com a câmara de eletroporação. Agora, selecione a ampliação de 20x no microscópio. No software do microscópio, certifique-se de que os canais FITC/GFP e A594 Texas Red M Cherry sejam selecionados correspondendo às duas proteínas fluorescentes no sistema FUCCI CA5. Use configurações de baixa exposição, normalmente menos de 0,05 segundos, para evitar danos à foto durante imagens de longo prazo. Faça imagens de teste para otimizar o foco e a qualidade da imagem antes de iniciar a imagem de lapso de tempo. Programe o lapso de tempo para capturar imagens de três a seis pontos de vista diferentes a cada 10 minutos durante um período de 24 horas para obter um alto volume de dados do ciclo celular por lapso de tempo enquanto mitiga os danos da foto. Certifique-se de que o foco automático esteja ativado para o canal A594 para otimizar o rastreamento da cultura durante o lapso de tempo. Deixe o software aberto até que a eletroporação seja concluída. Coloque a câmara de citometria de eletroporação no microscópio equipada com uma câmara ambiental apropriada. Antes da eletroporação, mantenha a câmara fechada e certifique-se de que o sistema ambiental permaneça funcionando para manter as condições adequadas do ciclo celular. Abra a câmara ambiental e conecte um multímetro digital ao gerador de pulsos e, em seguida, usando cabos de clipe jacaré, conecte o gerador de pulsos aos eletrodos da câmara. Carregue o capacitor do gerador de pulsos a 180 volts. Descarregue o pulso na câmara rapidamente até que o multímetro digital exiba zero volts. Remova todas as conexões elétricas da câmara e recoloque imediatamente a tampa da câmara para garantir as condições ideais de cultura. Ative a imagem de lapso de tempo imediatamente assim que a câmara ambiental estiver firmemente no lugar. Após a conclusão do lapso de tempo, use o software do microscópio para salvar todas as imagens capturadas como um único vídeo. Ajuste a qualidade visual para melhorar a clareza dos recursos da célula para quantificação manual. Finalmente, observe as mudanças nos sinais FITC e A594 ao longo do tempo para rastrear as fases da célula no vídeo de lapso de tempo. Usando o sistema Fuji, os dados visuais foram coletados rastreando as mudanças de cor ligadas à expressão e ubiquitinação da proteína, permitindo uma distinção clara das fases G1, S, G2, M. Isso permitiu a observação direta da progressão do ciclo celular sob condições variadas. Esta figura fornece um resumo dos principais dados coletados de dois conjuntos de experimentos usando culturas de células não sincronizadas e sincronizadas com a fase S. A exposição ao campo elétrico pulsado em células não sincronizadas aumentou significativamente a duração média das fases G1, G2 e M, enquanto a fase S permaneceu inalterada. Em células sincronizadas, a exposição ao campo elétrico pulsado levou a durações reduzidas das fases G1, S e G2, embora apenas S e G2 tenham sido estatisticamente significativas, enquanto a fase M permaneceu inalterada.