Preparação e Manutenção do Experimento de Gaiola IsoPositivo de Bioexclusão para Transplante Fecal Humano em Camundongos Livres de Germes

Estudamos a interação entre bactérias e o hospedeiro, e nosso fator interno e externo modificou essa relação para mudar a saúde. Especificamente, estamos interessados em entender o papel das bactérias no desenvolvimento, progressão e terapêutica do câncer. Nós e outros laboratórios de microbioma utilizamos o sistema de gaiola ISO positivo para transferir a comunidade fecal do sujeito humano para um hospedeiro murino receptor para criar uma comunidade microbiana estável e de longo prazo.

Essa tecnologia nos permitiu gerar uma nova descoberta sobre o papel das bactérias clínicas relevantes na saúde e na doença. Muitos ensaios clínicos prospectivos encontraram associações entre micróbios específicos e desenvolvimento, progressão e resposta ao tratamento do câncer, mas a correlação não implica causalidade. A humanização de camundongos livres de germes com amostras fecais humanas permite que a relação causal seja validada em modelos de câncer relevantes.

Usando o sistema de gaiola ISO positivo, demonstramos que cepas específicas de bacteroides de pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas respondedores à imunoterapia humana conferem uma resposta a camundongos portadores de tumores pulmonares ortotópicos. Para começar, coloque 10 lenços no tanque de imersão de esterilizante de dióxido de cloro e certifique-se de que estejam totalmente ensaboados. Em seguida, usando um cilindro graduado, encha um grande saco plástico com pelo menos 100 mililitros de esterilizante de dióxido de cloro.

Agite o saco para garantir que todas as superfícies internas estejam encharcadas e coloque-o de lado. Remova uma única gaiola ISO do rack e coloque-a no tanque de imersão de esterilizante de dióxido de cloro, garantindo contato total com o líquido. Use lenços umedecidos para esfregar todas as superfícies da gaiola.

Depois de molhar a gaiola, peça a um assistente que abra o saco plástico encharcado. Coloque a gaiola dentro e feche imediatamente a abertura. Usando um borrifador, borrife a abertura do saco com esterilizante de dióxido de cloro.

Depois que todas as gaiolas e suprimentos estiverem ensacados, mergulhe as luvas resistentes a produtos químicos em esterilizante de dióxido de cloro. Enquanto isso, mova os lenços embebidos para o gabinete de biossegurança e molhe todas as superfícies. Para superfícies não protegidas, aperte os lenços sobre eles sem tocá-los.

Após 20 minutos, usando luvas esterilizadas resistentes a produtos químicos, mova cada gaiola e garrafa para o armário de biossegurança esterilizado. Para abrir a gaiola ISO hermeticamente fechada, levante as abas brancas nos dois grampos nas laterais da tampa e puxe cada grampo lateralmente para destravar a tampa. Usando a pinça estéril dentro da gaiola em cima da gradinha, remova a garrafa de água vazia e coloque-a na parte interna da tampa.

Remova o selo de borracha e despeje água na garrafa para enchê-la. Usando uma pinça estéril, coloque o bico na garrafa de água e pressione firmemente para selar. Em seguida, com uma pinça estéril, levante a gradinha e deslize-a para trás vários centímetros para criar uma abertura para o fundo da gaiola.

Coloque a pinça estéril na grelha, certificando-se de que as alças não entrem em contato com as superfícies da gaiola. Ao receber o disco de transferência, peça ao assistente que segure e desembrulhe parcialmente a tampa plástica para que a superfície encharcada fique exposta, mas não tocada. Usando luvas resistentes a produtos químicos embebidas em esterilizante de dióxido de cloro, remova o disco de transferência da embalagem plástica e coloque-o em uma superfície plana dentro do gabinete de biossegurança esterilizado.

Para abrir o disco de transferência, retire a fita que veda a circunferência do disco e remova a tampa. Em seguida, usando a pinça estéril previamente apoiada na gradinha, manipule a tampa do compartimento para alinhar a abertura com o mouse a ser transferido. Empregando uma pinça estéril, segure a base da cauda do mouse através da abertura na tampa do disco de transferência, levante e transfira o mouse para a gaiola ISO através da abertura entre a grade e a gaiola.

Depois que todos os camundongos forem transferidos, substitua a grade pela pinça estéril. Levante a tampa da gaiola e coloque-a de volta em cima da gaiola. Levante cada clamp da tampa da gaiola para cima e abaixe-a cuidadosamente sobre as laterais da gaiola.

Empurre para baixo as abas brancas para selar firmemente a tampa da gaiola. Agora, peça ao assistente que pulverize cada bico do local de encaixe no rack da gaiola com esterilizante de dióxido de cloro. Remova a gaiola do gabinete de biossegurança e encaixe-a no rack da gaiola.

Amanhecer um novo avental cirúrgico estéril e luvas cirúrgicas estéreis no lugar das luvas resistentes a produtos químicos. Para preparar as agulhas de gavagem, desembrulhe cada bolsa de esterilização e use o interior da bolsa como uma superfície de descanso estéril seca. Conecte a agulha de gavagem à seringa.

Abra o tubo de pasta fecal e puxe 200 microlitros da pasta para cada seringa. Usando uma pinça, segure a base da cauda do mouse e coloque-a na gradinha. Contenha suavemente o mouse raspando a pele solta atrás do pescoço.

Enquanto segura o mouse na posição vertical vertical, insira a agulha de gavagem e injete suavemente a pasta fecal. Remova imediatamente a agulha após a injeção. Coloque o mouse diretamente em um dos copos esterilizados para observação.

Depois que todos os ratos receberem a gavagem, use uma pinça para mover cada camundongo de volta para a cama da gaiola. A estrutura da comunidade fecal de camundongos humanizados foi significativamente diferente entre os fenótipos de resposta em todos os três momentos. Os camundongos colonizados por fezes respondedoras não mostraram diferença na estrutura da comunidade microbiana entre as semanas um e dois e as semanas dois e quatro.

Enquanto as fezes não respondedoras, os camundongos colonizados mostraram uma estrutura de comunidade microbiana diferente entre as semanas um e dois, mas uma estrutura semelhante entre as semanas dois e quatro. Os inóculos de doadores humanos mostraram maior representação de Blautia, Eubacterium, ruminococcus e estreptococos, enquanto os camundongos receptores aumentaram a abundância relativa de bacteroides, Lachnoclostridium, Marvinbryantia e Parabecteroides.