Name: Preparação e Manutenção do Experimento de Gaiola IsoPositivo de Bioexclusão para Transplante Fecal Humano em Camundongos Livres de Germes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-28T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Aprenda a transferir camundongos livres de germes para isoladores ISO positivos e realizar transplante fecal humano. Este método estabelece comunidades microbianas estáveis para pesquisa sobre o papel da microbioma no câncer.

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Camundongos livres de germes são uma ferramenta essencial no repertório de pesquisadores de microbioma, permitindo dissecar a contribuição da microbiota na saúde do hospedeiro e nos estados de doença. Camundongos livres de germes nascem completamente estéreis e permanecem axênicos por toda a vida1. A colonização de camundongos livres de germes com cepas bacterianas específicas permite estudos causais entre esses táxons e funções metabólicas, imunológicas ou outras funções do hospedeiro 2,3,4,5. Particularmente vantajosa é a capacidade de "humanizar" camundongos livres de germes no nível da microbiota transplantando fezes obtidas de doadores humanos e, quando alojados em condições de barreira, evitar a contaminação por microrganismos derivados de murinos1. Essa abordagem permitiu muitas descobertas importantes no campo do microbioma, por exemplo, o efeito do microbioma intestinal humano na resposta à imunoterapia contra o câncer 6,7,8.
No entanto, embora camundongos humanizados livres de germes sejam inestimáveis para os esforços de pesquisa no campo do microbioma, existem muitas limitações que inibiram a adaptação mais ampla dessa abordagem. Camundongos livres de germes são criados e mantidos em grandes isoladores semirrígidos ou de filme flexível, mas experimentos funcionais requerem a configuração de mini-isoladores separados, com um mini-isolador abrigando várias gaiolas, mas apenas sob uma condição experimental. Essa abordagem de mini-isolador aumenta a pegada espacial e o custo, limitando severamente o número de condições experimentais que podem ser investigadas em um experimento e o número de experimentos que podem ser executados em paralelo. Uma solução promissora é o uso de um sistema de gaiola modular individual chamado Sistema de Bioexclusão ISOcage P (aqui referido como sistema de isocage) 9 , 10 . O sistema de isocáge permite a manipulação experimental de camundongos livres de germes em gaiolas isoladas individuais, hermeticamente fechadas e de pressão positiva, permitindo condições experimentais separadas entre cada gaiola em vez de entre cada mini-isolador. Com a técnica asséptica adequada, os animais podem ser alojados em isocages por até 12 semanas em condições livres de germes ou humanizados por transplante fecal humano para uso em qualquer abordagem experimental compatível (ou seja, pode ser realizado em condições assépticas). Vários experimentos independentes podem ser executados em paralelo usando o sistema de isocagem, e o espaço ocupado e o custo são drasticamente menores do que a execução de vários experimentos em mini-isoladores.
O objetivo da criação de camundongos livres de germes em isoladores de reprodução de filme flexível é preservar cuidadosamente o status axênico11. As técnicas usadas para monitorar o status livre de germes incluem swabs de rotina de superfícies corporais de camundongos e cavidades orais, bem como a coleta asséptica de amostras fecais, que são cultivadas e testadas por ensaios comerciais baseados em PCR. Testes bacterianos, sorológicos e fúngicos dessas amostras são necessários para determinar o status livre de germes11. Quando camundongos livres de germes são transferidos de isoladores reprodutores para isocages para uso experimental, os camundongos são esfregados e testados para validar seu status livre de germes após a transferência. As verificações de esterilidade do Isocángo são realizadas por meio da coleta asséptica de amostras fecais, que são então cultivadas para detecção de contaminantes bacterianos, virais e fúngicos. É necessário coletar e registrar cuidadosamente os resultados dessas verificações de esterilidade desde o nascimento até o final de um protocolo experimental para validar o status livre de germes desses camundongos.
O sistema de isogaiola é composto por gaiolas individuais (Figura 1), discos de transferência para transporte para fora dos isoladores de reprodução (Figura 1) e o rack de isocas, que abriga as gaiolas (Figura 2). Cada isocage contém um filtro de ar particulado de alta eficiência (HEPA) no nível da gaiola instalado na entrada de ar de alimentação e uma junta de silicone que faz uma vedação hermética quando fechada, garantindo que nenhum contaminante possa entrar na gaiola através do ar (Figura 1A). Esta tampa de gaiola pode ser usada como uma superfície de trabalho estéril quando colocada de cabeça para baixo dentro de um gabinete de biossegurança esterilizado (Figura 1A). Uma grade dentro da gaiola contém a garrafa de comida e água (Figura 1B). As pinças autoclavadas dentro da gaiola são usadas para todas as manipulações que requerem contato com as superfícies internas da gaiola. A gaiola em si tem entalhes para um porta-cartões de gaiola removível para identificar animais do lado de fora e bicos de entrada e exportação de ar que se encaixam no rack de isocage (Figura 1C-E). Fechamento seguro clamps e uma trava de aba na tampa vedam a gaiola quando ela estiver pronta para ser reencaixada no sistema de rack (Figura 1F). A roupa de cama sugerida é Alpha-dri, e uma cabana de enriquecimento autoclavável também é recomendada (Figura 1F). Os discos de transferência são usados para mover camundongos livres de germes dos isoladores reprodutores para as isócages e contêm uma tampa de compartimento giratório com uma abertura triangular para permitir a manipulação de animais (Figura 1G-H). Os discos vêm em tamanhos pequenos (21,6 cm de diâmetro) e grandes (28 cm de diâmetro), ambos com capacidade para oito ratos. A fita autoclavada é usada para criar vedações herméticas na circunferência e nos orifícios de ar do disco, o que é realizado antes da imersão com esterilizante e transporte em um saco embebido em esterilizante (Figura 1I). O próprio sistema de rack possui uma tela para monitorar os sopradores de ar, o status do filtro HEPA no nível do rack e a energia da bateria de emergência para o rack, que são recursos incluídos no sistema (Figura 2A). Um medidor Magnehelic fechado exibe a pressão positiva mantida pelo sistema de gaiola e um indicador visual automático de acoplamento mostra o status de acoplamento das gaiolas (a aba amarela significa que nenhuma gaiola está acoplada ou que o encaixe não foi bem-sucedido) (Figura 2B-D). Também é necessário para a manipulação de isocages um gabinete de biossegurança certificado padrão.
O protocolo aqui apresentado descreve os métodos adequados para a transferência bem-sucedida de camundongos livres de germes de isoladores reprodutores sob condições assépticas para as isocas, mantendo o status livre de germes, a humanização de camundongos livres de germes com chorume fecal de doadores humanos e a coleta de fezes de camundongos alojados na isocage para confirmação do status livre de germes ou preservação da viabilidade para estudos funcionais adicionais. Neste exemplo, camundongos livres de germes são humanizados com amostras fecais agrupadas de seres humanos tratados com imunoterapia para câncer de pulmão e dicotomizados como respondedores ou não respondedores à terapia. Nesse caso, o fenótipo de resposta à resposta à imunoterapia foi transferido pela humanização da microbiota intestinal para os camundongos receptores, que poderiam então ser inoculados com células tumorais e tratados com imunoterapia. O protocolo de chorume fecal humano pode ser prontamente adaptado a qualquer fezes de doador humano ou a qualquer modelo pré-clínico de doença que o investigador desejar. Usando este protocolo, é possível transferir qualquer microbiota de doador fecal humano para o hospedeiro livre de germes, permitindo uma investigação mais aprofundada sobre o papel da microbiota na saúde e na doença.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68029/68029fig01.jpg"> 
Figura 1: Diagrama esquemático dos discos de isociação e transferência. (A) Vista de cima para baixo da parte inferior da tampa da gaiola, com etiquetas indicando a localização do filtro HEPA interno no nível da gaiola e a vedação da junta de silicone. (B) Vista de cima para baixo do interior da gaiola, com etiquetas indicando a tampa da barra de arame, a garrafa de água interna e o bico, e a localização na grelha para armazenar ração autoclavável. (C) Vista frontal da gaiola mostrando entalhes para o titular do cartão da gaiola. (D) Vista de cima para baixo de uma gaiola completa com a tampa na parte superior, mostrando como o filtro HEPA está instalado no bocal de entrada de ar. (E). Vista traseira da gaiola mostrando a entrada de ar e os bicos de exportação que se encaixam no sistema de rack de isocage. (F) Vista lateral de uma gaiola completa com a tampa no topo, com etiquetas indicando os grampos de fechamento seguro na posição aberta, com abas brancas em cada grampo que os travam no lugar. O interior da gaiola mostra roupas de cama Alpha-dri em camadas na parte inferior e uma cabana de enriquecimento sugerida colocada na cama. (G) Vista de cima para baixo dos discos de transferência com a tampa na parte superior. (H) Vista de cima para baixo do interior do disco de transferência, mostrando a tampa do compartimento giratório com uma abertura triangular para permitir a manipulação de animais. (I) Vista lateral do disco de transferência totalmente montado mostrando a colocação de fita autoclavada, que cria uma vedação hermética durante a transferência do isolador de reprodução para o isocage. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68029/68029fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68029/68029fig02.jpg"> 
Figura 2: Diagrama esquemático do sistema de rack de isocage. (A) Rack de isocage completo com gaiolas acopladas e uma etiqueta indicando a tela de monitoramento do status do soprador de ar, status do filtro HEPA e bateria de emergência. No lado inferior esquerdo do rack está o slot para o filtro HEPA no nível do rack. (B) Medidor Magnehelic fechado mostrando a pressão positiva mantida pelo rack. (C) Uma instalação acoplada sem indicador de encaixe amarelo visível, demonstrando uma conexão bem-sucedida entre o rack e os bicos de ar. (D) Uma ranhura vazia no rack, com um indicador visual de encaixe automático visível indicando que nenhum rack está no lugar e não há conexão dos bicos de ar com um isocage. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68029/68029fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Seringa de ponta deslizante BD de 1 mL estéril, uso único</td><td>Fisher Scientific</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL Tampa de Rosca Tubo, Não Serrilhado, Saia, Natural, E-Beam Tubo estéril com tampa anexada</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-755-228</td><td></td></tr><tr><td>36 x 32 x 48" Sacos de Polietileno com Gusset de 3 Mil</td><td>Uline</td><td>S-13455</td><td></td></tr><tr><td>Tanque de 5 galões de ativador esterilizante de dióxido de cloro Exspor&nbsp;</td><td>A Ecolab</td><td>6301680</td><td></td></tr><tr><td>tanque de 5 galões de base esterilizante de dióxido de cloro Exspor&nbsp;</td><td>Copos de</td> polipropileno <td>Ecolab 6301194</td><td></td></tr><tr><td>600 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>S01914</td><td></td></tr><tr><td>ALPHA-dri Papéis</td> especiais <td>Shepherd</td><td></td><td></td></tr> Câmara <tr><td>anaeróbica</td><td>Coy Lab Products</td><td>Tipo B</td><td></td></tr><tr><td>Gabinete de biossegurança classe 2</td> Filtro HEPA autoclavável IsoCage certificado <td>pela Nuaire</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XT Extreme Temperature</td><td>Óculos de Segurança Tecniplast</td><td>1245ISOFHXT</td><td></td></tr><tr><td>Clear Lens LPX IQuity&nbsp;</td><td>Fastenal</td><td>922205455</td><td></td></tr><tr><td>DuPont&nbsp; Tyvek&nbsp; Manga - 18"</td><td>Uline</td><td>S-13893E</td><td></td></tr><tr><td>DWK Life Sciences DURAN 45 mm Push-on Tampa de Borracha Natural Fisher</td><td>Scientific</td><td>01-258-107</td><td>Tampa de borracha para garrafas de 1 L autclave</td></tr><tr><td>Garrafas de pulverizador HDPE Dynalon Quick Mist Fisher</td><td>Scientific</td><td>03-438-12B</td><td></td></tr><tr><td>Cilindros graduados de polipropileno Fisherbran</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-007-44</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbran&nbsp; Pinça de Dissecação de Ponta Cega</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-887</td><td></td></tr><tr><td>Bolsas de Esterilização de Selagem Instantânea Fisherbrand</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-812-51</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de Aplicação Geral de Ponta Larga Forte da Fisherbrand&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-107</td><td></td></tr><tr><td>Marca Fisher&nbsp; Fita Autoclave Sem Chumbo</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-901-110</td><td></td></tr><tr><td>Agulha de gavagem, aço inoxidável reutilizável. Reto. Agulha de 22 gauge, diâmetro da ponta 1,25 mm, comprimento 38 mm ou 1,5 polegadas(doz)</td><td>Braintree Scientific</td><td>N-PK 020</td><td></td></tr><tr><td>H-B Instrumento Durac Timer</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-202-015</td><td></td></tr><tr><td>IsoPositive Cages and Rack (i.e. isocages)</td><td>Tecniplast&nbsp; &nbsp;</td><td>ISO30P</td><td>30 gaiolas (6 l x 5 a), luvas</td></tr> de <tr><td>nitrilo resistentes a produtos químicos de um lado Tamanho S (7), M (8) ou L (9) 18" de comprimento, 22 mil, Luvas</td> de exame de nitrilo Ansell <td>Grainger</td><td>4T426</td><td></td></tr><tr><td>, médias, não estéreis, sem pó</td><td>MedSupply Partners</td><td>KG-1101M</td><td></td></tr><tr><td>Gás de baioneta oliva / magenta Cartuchos de Vapor / Filtro de Partículas 2Ct&nbsp;</td><td>&nbsp; 3M/Fastenal</td><td>50051138541878</td><td></td></tr><tr><td>Policarbonato RadDisk Mini para Ratos 8-75 x 4</td><td>Braintree Scientific</td><td>IRD-P M</td><td></td></tr><tr><td>Polipropileno Bouffant Caps - 24", Azul</td><td>Uline</td><td>S-10480BLU</td><td></td></tr><tr><td>Puritan Cary-Blair Medium, 5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-029-646</td><td></td></tr><tr><td>S, M e L Máscara Respiradora de Cabeça de Silicone Azul de Modo Duplo&nbsp;</td><td>&nbsp; Luvas</td><td></td> de látex sem pó estéreis da série 50051131370826 <td></td>Sgpf da 3M/Fastenal</tr><tr><td>, CT International, Espessura = 6,5 mm, Comprimento = 30,5 cm (12), Tamanho da luva = 8,5, Cor da luva = Branco</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-999-102F</td><td></td></tr><tr><td>Capa de sapato resistente ao deslizamento</td><td>Uline</td><td>&nbsp; S-25639</td><td></td></tr><tr><td>Bata Cirúrgica, Toalha, Estéril, Grande, 32/cs</td><td>Thomas Scientific</td><td>KIM 95111</td><td></td></tr><tr><td>Teklad Global 18% proteína extrudada dieta para roedores (esterilizável)&nbsp;</td>Tanque LLDPE Retangular <td>Pesado Nalgene da Inotiv</td><td>2018SX</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific com Tampa (volume de 20 L)</td><td>Thermo Scientific</td><td>14-831-330J</td><td></td></tr><tr><td>VERIFY Indicadores Biológicos Autônomos de Duas Espécies</td><td>Steris Healthcare</td><td>S3061</td><td></td></tr><tr><td>WypAll L40 1&frasl; Limpadores de 4 dobras</td><td>Uline</td><td>S-8490</td><td></td></tr></tbody></table>

preparação e manutenção do experimento de gaiola isopositivo de bioexclusão para transplante fecal humano em camundongos livres de germes

Preparation and Maintenance of Bioexclusion IsoPositive Cage Experiment for Human Fecal Transplantation into Germ-Free Mice

Amostras fecais humanas, agrupadas por fenótipo ICI respondedor e não respondedor (descrito anteriormente no protocolo), foram gavagadas em camundongos GF-WT de gênero misto alojados em 3 isócrias por grupo (n = 1-2 camundongos / gaiola, n = 6 para respondedor e n = 5 para não respondedor). Os camundongos foram autorizados a se aclimatar por 1 semana após a transferência. Amostras fecais foram então coletadas desses camundongos (condições livres de germes). Os camundongos foram então gavagados com 1 × 107 UFC ...

Preparação e Manutenção do Experimento de Gaiola IsoPositivo de Bioexclusão para Transplante Fecal Humano em Camundongos Livres de Germes

Germ-free mice are an important investigation tool for understanding the contribution of microorganisms in host health and disease, enabling assessment of ...

preparation-maintenance-bioexclusion-isopositive-cage-experiment-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra o método para gerar um camundongo BLT ósseo humanizado duplo (medula, fígado e timo) com um sistema imunológico humano funcional e um microbioma intestinal humano enxertado estável.

Gerando um modelo de camundongo BLT (medula óssea, fígado, timo) duplamente humanizado

Este vídeo demonstra um procedimento de transplante de microbiota fecal em um camundongo deficiente em interleucina-10 com inflamação do cólon. Os micróbios fecais colonizados no intestino liberam metabólitos secundários, provocando a liberação de citocinas anti-inflamatórias e reduzindo a inflamação do cólon.

Avaliando os efeitos do transplante de microbiota fecal em um camundongo deficiente em interleucina-10

Há um interesse crescente na caracterização quantitativa de linfócitos intestinais devido ao crescente reconhecimento de que essas células desempenham um papel crítico em uma variedade de doenças intestinais e sistêmicas. Neste protocolo, descrevemos como isolar populações de células únicas de diferentes compartimentos do intestino delgado para posterior caracterização por citometria de fluxo.

Isolamento e Caracterização de citometria de fluxo de linfócitos de murino Intestino Delgado

Nós descrevemos um método novo para gerar os BLT-ratos humanizados dobro que caracterizam um sistema imune humano funcional e um microbioma humano-como enxertado estável do intestino. Este protocolo pode ser seguido sem a necessidade para ratos germe-livres ou facilidades gnotobióticos.

Um duplo humanizado BLT-MICE modelo caracterizando um estável humano-como o intestino Microbiome e sistema imunológico humano

A interação da suscetibilidade genética, imunidade mucosa e ambiente microecológico intestinal está envolvida na patogênese da doença inflamatória intestinal (DII). Neste estudo, aplicamos o transplante de microbiota fecal em camundongos deficientes de IL-10 e investigamos seu impacto na inflamação cólon e na função cardíaca.

Avaliação Terapêutica do Transplante de Microbiota Fecal em um Modelo de Camundongo deficiente interleucina

O objetivo aqui é delinear um protocolo para investigar os mecanismos de disbiose na doença cardiovascular. Este artigo discute como coletar e transplantar amostras fecais murinas assepticamente, isolar intestinos e usar o método "Swiss-roll", seguido por técnicas de imunomarcação para interrogar alterações no trato gastrointestinal.

Isolamento Fecal Murino e Transplante de Microbiota

Aqui, descrevemos a estrutura e os procedimentos operacionais, incluindo medidas de contenção microbiana de uma instalação para "camundongos selvagens" usando amostragem de sangue para imunofenotipagem como exemplo.

Procedimentos Operacionais e de Biocontenção de uma Instalação para Camundongos de Laboratório com Microbioma Natural: Procedimento de Imunofenotipagem

Este protocolo detalha a montagem de matrizes de mini-biorreatores a serem utilizados para cultura de fluxo contínuo de comunidades fecais complexas sob condições anaeróbicas. Também discutimos os métodos de montagem, inoculação e amostragem dos reatores para análise posterior.

Montagem de biorreatores para cultura contínua de comunidades fecais complexas

Este protocolo descreve as etapas necessárias para a colonização de camundongos com pks+ Escherichia coli em condições não inflamatórias, bem como métodos não invasivos para validação da colonização e avaliação da expansão de pks+ E. coli nas fezes.

Colonização com Escherichia coli de Murine pks+ Escherichia coli sob condições não inflamatórias

Estudos de pesquisa a doença de Lyme muitas vezes exigem a geração de carrapatos infectados com o patógeno Borrelia burgdorferi, um processo que normalmente leva várias semanas. Aqui nós demonstramos uma microinjeção baseado procedimento de infecção do carrapato que pode ser realizado em poucas horas. Nós também demonstramos um método de imunofluorescência para na localização in situ de B. burgdorferi dentro de carrapatos.

Métodos para a transferência rápida e localização de Patógenos Doença de Lyme no intestino Tick

Aprenda a transferir camundongos livres de germes para isoladores ISO positivos e realizar transplante fecal humano. Este método estabelece comunidades microbianas estáveis para pesquisa sobre o papel da microbioma no câncer.

Preparação e Manutenção do Experimento de Gaiola IsoPositivo de Bioexclusão para Transplante Fecal Humano em Camundongos Livres de Germes (Vídeo) | JoVE Journal

Preparação e Manutenção do Experimento de Gaiola IsoPositivo de Bioexclusão para Transplante Fecal Humano em Camundongos Livres de Germes

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