Name: Regulação quimiogenética em células-tronco precursoras derivadas de células-tronco reprogramadas no tratamento de doenças neurodegenerativas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Aprenda a reprogramar células-tronco quimicamente em precursores dopaminérgicos para terapia de Parkinson. Este método utiliza CRISPR e avaliação eletrofisiológica em modelos murinos para restaurar função neural.

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<ol><li>Thiel, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aThiel%2C+G+%22Designer+receptors+exclusively+activated+by+designer+drugs%22">Designer receptors exclusively activated by designer drugs</a>. , Humana Press. (2015).</li>
<li>Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dreadds+for+neuroscientists%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dreadds for neuroscientists.</a> Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).</li>
<li>Gomez, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemogenetics+revealed%3A+DREADD+occupancy+and+activation+via+converted+clozapine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine.</a> Science. 357 (6350), 503-507 (2017).</li>
<li>Chehelgerdi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+promising+potential+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+cancer+research+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Exploring the promising potential of induced pluripotent stem cells in cancer research and therapy.</a> Mol Cancer. 22 (1), 189(2023).</li>
<li>Song, J., Patel, R. V., Sharif, M., Ashokan, A., Michaelides, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemogenetics+as+a+neuromodulatory+approach+to+treating+neuropsychiatric+diseases+and+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Chemogenetics as a neuromodulatory approach to treating neuropsychiatric diseases and disorders.</a> Mol Ther. 30 (3), 990-1005 (2022).</li>
<li>Parmar, M., Grealish, S., Henchcliffe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+stem+cell+therapies+for+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The future of stem cell therapies for Parkinson disease.</a> Nat Rev Neurosci. 21 (2), 103-115 (2020).</li>
<li>Dell'anno, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+control+of+induced+dopaminergic+neurons+in+Parkinsonian+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Remote control of induced dopaminergic neurons in Parkinsonian rats.</a> J Clin Invest. 124 (7), 3215-3229 (2014).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+control+of+grafted+human+PSC-derived+neurons+in+a+mouse+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Chemical control of grafted human PSC-derived neurons in a mouse model of Parkinson's disease.</a> Cell Stem Cell. 18 (6), 817-826 (2016).</li>
<li>Bjorklund, A., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+cell+therapy%3A+From+cell+replacement+to+circuitry+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parkinsons+Dis%22%5BJournal%5D)">Dopamine cell therapy: From cell replacement to circuitry repair.</a> J Parkinsons Dis. 11 (S2), S159-S165 (2021).</li>
<li>Alcacer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemogenetic+stimulation+of+striatal+projection+neurons+modulates+responses+to+Parkinson%27s+disease+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Chemogenetic stimulation of striatal projection neurons modulates responses to Parkinson's disease therapy.</a> J Clin Invest. 127 (2), 720-734 (2017).</li>
<li>Alexander, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+control+of+neuronal+activity+in+transgenic+mice+expressing+evolved+G+protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Remote control of neuronal activity in transgenic mice expressing evolved G protein-coupled receptors.</a> Neuron. 63 (1), 27-39 (2009).</li>
<li>Stachniak, T. J., Ghosh, A., Sternson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemogenetic+synaptic+silencing+of+neural+circuits+localizes+a+hypothalamus+midbrain+pathway+for+feeding+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Chemogenetic synaptic silencing of neural circuits localizes a hypothalamus midbrain pathway for feeding behavior.</a> Neuron. 82 (4), 797-808 (2014).</li>
<li>Kang, H. J., Minamimoto, T., Wess, J., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemogenetics+for+cell-type-specific+modulation+of+signalling+and+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Chemogenetics for cell-type-specific modulation of signalling and neuronal activity.</a> Nat Rev Methods Primers. 3 (1), 93(2023).</li>
<li>Miyanishi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+tests+predicting+striatal+dopamine+level+in+a+rat+hemi-Parkinson%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Int%22%5BJournal%5D)">Behavioral tests predicting striatal dopamine level in a rat hemi-Parkinson's disease model.</a> Neurochem Int. 122, 38-46 (2019).</li>
<li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+IPSC-derived+midbrain+organoids+functionally+integrate+into+striatum+circuits+and+restore+motor+function+in+a+mouse+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Human IPSC-derived midbrain organoids functionally integrate into striatum circuits and restore motor function in a mouse model of Parkinson's disease.</a> Theranostics. 13 (8), 2673-2692 (2023).</li>
<li>Xiong, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+stem+cell-derived+neurons+repair+circuits+and+restore+neural+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human stem cell-derived neurons repair circuits and restore neural function.</a> Cell Stem Cell. 28 (1), 112-126.e6 (2021).</li>
<li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+precursors+differentiated+from+human+blood-derived+induced+neural+stem+cells+improve+symptoms+of+a+mouse+Parkinson%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic precursors differentiated from human blood-derived induced neural stem cells improve symptoms of a mouse Parkinson's disease model.</a> Theranostics. 8 (17), 4679(2018).</li>
<li>Zhu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+acute+spinal+cord+slices+for+whole-cell+patch-clamp+recording+in+substantia+gelatinosa+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of acute spinal cord slices for whole-cell patch-clamp recording in substantia gelatinosa neurons.</a> J Vis Exp. (143), (2019).</li>
<li>Wang, X., Han, D., Zheng, T., Ma, J., Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+human+induced+neural+stem+cell-derived+dopaminergic+neurons+by+DREADD+reveals+therapeutic+effects+on+a+mouse+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Modulation of human induced neural stem cell-derived dopaminergic neurons by DREADD reveals therapeutic effects on a mouse model of Parkinson's disease.</a> Stem Cell Res Ther. 15 (1), 297(2024).</li>
<li>Iancu, R., Mohapel, P., Brundin, P., Paul, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+characterization+of+a+unilateral+6-OHDA-lesion+model+of+Parkinson%27s+disease+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Behavioral characterization of a unilateral 6-OHDA-lesion model of Parkinson's disease in mice.</a> Behav Brain Res. 162 (1), 1-10 (2005).</li>
<li>Surmeier, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+dopamine+in+modulating+the+structure+and+function+of+striatal+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The role of dopamine in modulating the structure and function of striatal circuits.</a> Prog Brain Res. 183, 148-167 (2010).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>2 x Rapid Taq Master Mix</td><td>Vazyme</td><td>P222-01</td><td>usado para análise de genotipagem</td></tr><tr><td>2&times; Mistura de clonagem sem costura</td><td>Biomed Gene Tech.</td><td>CL117-01</td><td>usado para construção de plasmídeo</td></tr><tr><td>6-OHDA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4381</td><td>usado para estabelecer camundongos PD modelo</td></tr><tr><td>AAVS1-Pur-CAG-EGFP</td><td>Addgene</td><td>80945</td><td>usado como controle&nbsp;</td></tr><tr><td>AAVS1-Pur-CAG-hM4Di-mCherry</td><td>Addgene</td><td>80947</td><td>plasmídeo original para construção de hM4Di-T2A-ZsGreen</td></tr><tr><td>AAVS1-Pur-CAG-hM3Dq-mCherry</td><td>Addgene</td><td>80948</td><td>plasmídeo original para construção de hM3Dq-T2A-ZsGreen</td></tr><tr><td>AAVS1-CAG-hM4Di-T2A-ZsGreen</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Plasmídeo doador construído com base em #80947</td></tr><tr><td>AAVS1-CAG-hM3Dq-T2A-ZsGreen</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Plasmídeo doador construído com base em # 80948</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Invitrogen</td><td>A11105-01</td><td>Usado para digerir células</td></tr><tr><td>AMAXA Nucleofector</td><td>Lonza</td><td>AAD-1001S</td><td></td></tr><tr><td>Apomorfina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4393</td><td></td></tr><tr><td>Líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF)</td> <td>N / A</td><td>N / A</td><td>125 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 2 mM de CaCl2, 1,25 mM de NaH2PO4, 1 mM de MgSO4, 25 mM de glicose e&nbsp; 26 mM NaHCO3</td></tr><tr><td>Ácido ascórbico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1043003</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Suplemento</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0627</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Yeasen</td><td>53003ES10</td><td></td></tr><tr><td>Clozapina-N-óxido</td><td>Enzo</td><td>BML-NS105</td><td></td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5942</td><td></td></tr><tr><td>Desipramina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D3900</td><td></td></tr><tr><td>D-glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>FGF8</td><td>Peprotech</td><td>100-25</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s Solução salina balanceada (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>Fator inibidor da leucemia humana (hrLIF)</td><td>Milipore</td><td>LIF1010</td><td></td></tr><tr><td>Fluido intracelular gelado</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>130 mM K-gluconato, 16 mM KCl, 0,2 mM EGTA, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 4 mM Na2-ATP, 0,4 mM Na3-GTP, 0,3% de neurobiotina</td></tr><tr><td>KnockOut Reposição</td> de soro <td>Gibco</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Roche</td><td>11243217001</td><td></td></tr><tr><td>Extrator de micropipetas</td><td>Suplemento Sutter Instrument Company</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Thermo</td><td>Fisher</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal-A Medium</td><td>Gibco</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>Amino não essencial ácidos (NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>pCLAMP 11 pacote de software</td><td>Molecular Devices</td><td>N/A</td><td>Patch-clamp electrophysiology software de aquisição e análise de dados</td></tr><tr><td>Fase 1 meio de diferenciação</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>96% DMEM/F12 (Gibco, 11320-033), 1% Suplemento B-27, 1% Suplemento N-2, 1% NEAA, 1% GlutaMax, 1 &micro; M SAG1 e 100 ng/mL FGF8&nbsp;</td></tr><tr><td>Meio de diferenciação da Fase 2</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>96% DMEM/F12 (Gibco, 11320-033), 1% Suplemento B-27, 1% Suplemento N-2, 1% NEAA e 1% GlutaMax, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL GDNF, 1 ng/mL TGF-&beta; III, 10 &micro; M DAPT, 0,2 mM de ácido ascórbico e 0,5 mM de cAMP.</td></tr><tr><td>Bromidrato de poli-D-lisina (PDL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7886</td><td></td></tr><tr><td>Primers para genotipagem</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Inserção Avançar: TCTTCACTCGCTGGGTTCCCTT; Inserção Reversa: CCTGTGGGAGGAAGAAGAGGT; Homozigosidade para frente:CGTCTCCCTGGCTTTAGCCA; Homozigosidade reversa: GATCCTCTCTGGCTCCATCG</td></tr><tr><td>pX458</td><td>Addgene</td><td>152199</td><td></td></tr><tr><td>SAG1</td><td>Enzo</td><td>ALX-270-426-M01</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Yeasen</td><td>53004ES50</td><td></td></tr><tr><td>líquido cefalorraquidiano artificial à base de sacarose (s-ACSF)</td><td></td><td></td><td>234 mM de sacarose, 2,5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1,25 mM NaH2PO4, 11 mM de Dglicose, 0,5 mM de CaCl2 e 10 mM de MgSO4</td></tr><tr><td>Cultura de células-tronco mídia</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>&NBSP; 48% DMEM/F12 (Gibco, 11330-032) e 48% Neurobasal, com adição de 1% de B27, 1% de N2, 1% de NEAA, 1% de GlutaMax, 10 ng/mL de hrLIF, 2 &micro; M SB431542 e 3 &micro; M CHIR99021</td></tr><tr><td>TGF-&beta; III</td><td>Peprotech</td><td>100-36E</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de transplante</td><td>N/</td><td>A N/A</td><td>HBSS tampão com 5 g/L de D-glicose, 100 ng/mL de BDNF, 100 ng/mL de GDNF e 0,2 mM de ácido ascórbico</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica&nbsp;</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr>Dispositivos <td>Moleculares</td> de<td>Patch de Célula Inteira</td><td> MultiClamp700B</td><td></td></tr></tbody></table>

regulação quimiogenética em células-tronco precursoras derivadas de células-tronco reprogramadas no tratamento de doenças neurodegenerativas

Chemogenetic Regulation in Reprogrammed Stem Cell-derived Precursor Cells in Treating Neurodegenerative Diseases

A Figura 1 mostra as principais etapas desta abordagem metodológica para células-tronco humanas reprogramadas projetadas expressando receptores DREADD excitatórios (hM3Dq) ou inibitórios (hM4Di) para avaliar a integração funcional e modulação de precursores dopaminérgicos derivados em um modelo de camundongo da doença de Parkinson (DP). A Figura 2 descreve a estratégia de knock-in de genes mediada por CRISPR / Cas9 para a introdução de construções de não fusão d...

Regulação quimiogenética em células-tronco precursoras derivadas de células-tronco reprogramadas no tratamento de doenças neurodegenerativas

The integration of designer receptors exclusively activated by designer drugs (DREADD) with stem cell-based therapies presents an advanced strategy for ...

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Neurogênese cortical: Transição do Avanços no Laboratório de terapias baseadas em células

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Reprogramação direta de células progenitoras hematopoiéticas em células-tronco neurais

Fonte: Sharma, A. D., et.al. Caracterização de alto rendimento de células-tronco adultas projetadas para entrega de fatores terapêuticos para estratégias neuroprotetoras. J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo demonstra o processo de caracterização de células-tronco mesenquimais transgênicas projetadas para expressar fatores neurotróficos terapêuticos. Ele descreve as etapas envolvidas na fixação, permeabilização e coloração das células com anticorpos primários e secundários direcionados a um marcador...

Caracterização de células-tronco mesenquimais geneticamente modificadas para aplicações neuroterapêuticas

Este protocolo descreve um método de desbastamento mecânico novela que permite a expansão de células progenitoras e estaminais neurais agregados esféricos sem dissociação de uma única suspensão de células. Manter contato célula / célula permite um crescimento rápido e estável por mais de 40 passagens.

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High Throughput caracterização de células-tronco adultas modificadas para liberação de fatores terapêuticos como estratégia de neuroproteção

Geração de células estaminais pluripotentes induzidas proporciona perspectivas fascinantes para a derivação de transplantes autólogos. No entanto, a progressão através de um estado pluripotente e trabalhoso re-diferenciação ainda dificulta a tradução clínica. Aqui nós descrevemos a derivação de fibroblastos humanos adultos ea sua conversão direta em células progenitoras neurais induzidos ea subsequente diferenciação em linhagens neuronais.

Derivação de adultos fibroblastos humanos e sua conversão direta em Expansível Neural células progenitoras

Reprogramação neuronal direta gera neurônios que mantêm a idade da célula somática inicial. Aqui, descrevemos um método baseado em vetor único para gerar neurônios induzidos de fibroblastos dérmicos obtidos de doadores humanos adultos.

Simples geração de uma cultura de alto rendimento de neurônios induzidas de fibroblastos de pele humana adulta

O protocolo apresenta a reprogramação de células mononucleares do sangue periférico para induzir células-tronco neurais por infecção pelo vírus de Sendai, diferenciação de iNSCs em neurônios dopaminérgicos, transplante de precursores da DA na unilateralmente lesionada Modelos do rato da doença de Parkinson, e avaliação da segurança e da eficácia de precursores DA DA do iNSC-derivados para o tratamento do paládio.

Geração de células-tronco neurais induzidas de células mononucleares periféricas e diferenciação para precursores de neurónios dopaminérgicos para estudos de transplante

Apresentamos um método geneticamente livre de modificações (livre de GM) para obter células com um fenótipo neuronal de células sanguíneas periféricas reprogramadas. A ativação de uma via de sinalização ligada à nova proteína ligada ao GPI humano revela um método eficiente livre de GM para a obtenção de células-tronco pluripotentes humanas.

Geração livre de células neuronais derivadas do sangue

Descrevemos um protocolo para reprogramar fibroblastos derivados da pele humana em células progenitoras neuronais induzidas (iNPCs), e sua subsequente diferenciação em Astrocitos induzidos (iAs). Este método leva a uma geração rápida e reprodutível de iNPCs e iAs em grandes quantidades.

Modelagem in vitro para doenças neurológicas usando conversão direta de fibroblastos para células progenitoras neuronais e diferenciação em astrócitos

O transplante de neurônios GABAérgicos derivados de células-tronco pluripotentes humanas gerados pela programação neuronal pode ser uma abordagem de tratamento potencial para distúrbios do neurodesenvolvimento. Este protocolo descreve a geração e o transplante de precursores neuronais GABAérgicos derivados de células-tronco humanas no cérebro de camundongos neonatais, permitindo a investigação a longo prazo de neurônios enxertados e a avaliação de seu potencial terapêutico.

Transplante de neurônios gabaérgicos derivados de células-tronco humanas no hipocampo de camundongo pós-natal precoce para mitigar distúrbios do neurodesenvolvimento

Aprenda a reprogramar células-tronco quimicamente em precursores dopaminérgicos para terapia de Parkinson. Este método utiliza CRISPR e avaliação eletrofisiológica em modelos murinos para restaurar função neural.

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