Regulação quimiogenética em células-tronco precursoras derivadas de células-tronco reprogramadas no tratamento de doenças neurodegenerativas

Nossa pesquisa se concentra em ilustrar o mecanismo patogênico subjacente à doença neurodegenerativa, ao mesmo tempo em que integra tecnologias avançadas para desenvolver técnicas eficazes de terapia celular para aplicações clínicas. Nosso trabalho recente transplantou células-tronco quimiogeneticamente modificadas em modelos de camundongos com doença de Parkinson. Modulamos as atividades dos neurônios de uma célula com drogas projetadas, portanto, monitoramento eletrofisiológico e avaliação comportamental. Utilizamos principalmente CRISPR para engenharia genética, eletrofisiologia para monitorar a atividade neural e ensaio comportamental para avaliar a recuperação da função em modelos de doença de Parkinson. A eficiência das células do enxerto aumenta com a indicação adequada, sobrevivência e contribuição funcional para o tecido hospedeiro na terapia baseada em células-tronco, tratando doenças neurodegenerativas. Atividade celular descontrolada relacionada a consequências negativas, incluindo a gênese do tumor.

Alavancar a tecnologia em células-tronco reprogramadas humanas e neurônios condutores fornece os meios para controlar com precisão as atividades neuronais por meio da administração do medicamento designer CNO.

[Instrutor] Para começar, misture suavemente 50 a 100 nanogramas do vetor linearizado, fragmento um e fragmento dois, em uma proporção de um para três a três molares, juntamente com a mistura de clonagem 2X. Incube a mistura a 55 graus Celsius por uma hora para facilitar a recombinação homóloga usando a montagem de Gibson. Insira o RNA guia direcionado ao local AAVS1 no local BBS1 do vetor PX458. Manter as células-tronco reprogramadas em meios de cultura, visando uma densidade celular entre dois a 5 milhões de células por mililitro. Agora, misture de dois a 5 milhões de células, dois microgramas de cada plasmídeo doador e dois microgramas de plasmídeo GRNA em 100 microlitros de tampão de eletroporação. Transfira a mistura de células e plasmídeos para uma cubeta para realizar a eletroporação. Em seguida, transfira as células eletroporadas para placas de seis poços que foram revestidas com poli-D-lisina e laminina. Distribua aproximadamente 500.000 células por poço em dois mililitros de meio de cultura. Após 72 horas de eletroporação, use um citômetro de fluxo para classificar as células positivas fluorescentes. Configure o classificador com o canal FITC para detecção de ZsGreen. Inclua células-tronco neurais induzidas não tratadas como controles negativos para definir a fluorescência basal. Plaquee células ZsGreen positivas em placas de 96 poços pré-revestidas com poli-D-lisina e laminina e adicione 200 microlitros de meio de cultura por poço. Mantenha a cultura por sete a 14 dias. Isole clones únicos exibindo fluorescência usando um microscópio de fluorescência invertida equipado com um conjunto de filtros de proteína fluorescente verde. Depois de expandir as células positivas em placas revestidas de 48 poços, divida-as em duas partes, uma para cultura continuada e outra para genotipagem. Extraia o DNA genômico dos clones candidatos. Prepare a mistura de PCR usando dois reparos principais, um para confirmar a inserção do gene de interesse e outro para distinguir entre clones homozigotos e heterozigotos. Digerir as células, lavá-las em PBS e centrifugar a 250 G durante três minutos. Realizar injeções estereotáxicas unilaterais de três microlitros de 6-hidroxidopamina a uma concentração de cinco microgramas por microlitro no animal anestesiado. Direcione o corpo estriado direito usando as coordenadas corretas. Administre uma injeção intraperitoneal de apomorfina a um miligrama por quilograma usando uma solução de 0,5 miligrama por mililitro dissolvida em solução salina quatro semanas após a cirurgia para validar as lesões. Administre uma injeção estereotáxica de quatro microlitros da suspensão celular preparada no modelo de camundongo com doença de Parkinson. Realize o teste do cilindro em vários momentos após o transplante de células. Coloque um copo de vidro com 20 centímetros de diâmetro e 30 centímetros de altura em uma superfície plana e não reflexiva. Em seguida, posicione uma câmera de visão superior acima do cilindro para capturar o diâmetro total. Coloque cada mouse no centro do cilindro e inicie a gravação de vídeo simultânea por três minutos por sessão. Após a sessão, retorne o mouse à sua gaiola inicial. Avalie o movimento dos membros superiores dos camundongos durante a sessão de três minutos. Calcule o número de contatos de parede feitos pelo membro anterior prejudicado em relação ao total de contatos feitos por ambos os membros anteriores. Administre solução salina ou N-óxido de clozapina na dosagem de 1,2 miligramas por quilograma por meio de injeção intraperitoneal. Realize o teste do cilindro novamente para avaliar a modulação comportamental no modelo de camundongo com doença de Parkinson após a administração de N-óxido de clozapina. Depois de extrair o cérebro do animal anestesiado e colocá-lo imediatamente no líquido cefalorraquidiano artificial à base de sacarose gelada para preservar a integridade celular Usando um vibratoma, corte o cérebro em seções de 300 a 400 micrômetros de espessura. Ajuste as configurações de entrada de gás para equilibrar com 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono a 34 graus Celsius. Transfira as fatias do cérebro para uma câmara cheia de líquido cefalorraquidiano artificial. Carregue pipetas de vidro com solução intracelular gelada, garantindo que a resistência do eletrodo esteja entre sete a 10 megaohms. Monte fatias em uma câmara de gravação submersa superfundida a dois mililitros por minuto com líquido cefalorraquidiano artificial oxigenado a 34 graus Celsius. Posicione pipetas usando micromanipuladores motorizados sob microscopia de contraste de interferência diferencial infravermelha. Estabeleça a configuração da célula inteira usando sucção suave para remendar neurônios com resistência superior a um gigaohm. Prenda as células a menos 70 milivolts usando um amplificador patch clamp e adquira correntes pós-sinápticas excitatórias espontâneas basais por oito minutos a uma taxa de amostragem de 10 kilohertz. Adicionar 50 N-óxido de clozapina micromolar à câmara de registo imediatamente após a medição inicial. Continue registrando dados por 16 minutos e monitore as mudanças na frequência ou amplitude da corrente pós-sináptica excitatória espontânea. Finalmente, execute um procedimento de lavagem substituindo a solução de N-óxido de clozapina por líquido cefalorraquidiano artificial fresco e continue registrando para avaliar a recuperação da atividade sináptica. A modulação hemogenética usando N-óxido de clozapina reduziu o movimento contralateral do membro anterior em camundongos transplantados com hM4Di e o aumentou em camundongos transplantados com hM3Dq em comparação com o tratamento com solução salina, demonstrando controle comportamental bidirecional. Os registros eletrofisiológicos revelaram que as células transplantadas com hM4Di apresentaram intervalos mais longos e amplitudes de pico menores nas correntes pós-sinápticas excitatórias espontâneas, enquanto as células transplantadas com hM3Dq apresentaram intervalos mais curtos e amplitudes maiores, indicando respectiva supressão e aumento da atividade sináptica. A análise de imunofluorescência confirmou a expressão in vivo de tirosina hidroxilase e ZsGreen nas células hM4Di e hM3Dq transplantadas, apoiando a integração bem-sucedida do enxerto.