Montagem de biorreatores para cultura contínua de comunidades fecais complexas

Estudamos as interações entre as bactérias hospedeiras e como os fatores intrínsecos e extrínsecos influenciam a saúde, com foco nos efeitos bacterianos no desenvolvimento, progressão e resposta ao tratamento do câncer. Estudamos inibidores de checkpoint imunológico anti-PD-1 em comunidades bacterianas, descobrindo que os metabólitos bacterianos aumentam a eficácia da terapia anti-PD-1.

Isolar o impacto dos fatores do hospedeiro no microbioma in vivo é um desafio devido a múltiplas influências. A matriz de microbiorreatores permite o exame controlado de processos específicos, esclarecendo seus efeitos diretos nas comunidades microbianas. Este protocolo oferece um método econômico para cultivar comunidades fecais sob condições controladas, permitindo que os pesquisadores executem experimentos em paralelo com relativa rapidez.

[Instrutor] Para começar, obtenha um conjunto de reatores de seis poços impressos em 3D. Corte doze tiras de 25 milímetros de tubos de PTFE de 1/8 de polegada e use uma navalha para raspar as pontas. Insira uma extremidade de cada tira na abertura da rosca de um Luer macho com um encaixe de 25 a 28 roscas. Aparafuse firmemente as conexões nas aberturas designadas de resíduos e amostras da matriz. Agora, insira uma barra de microagitação em cada poço do reator. Aparafuse um encaixe de rosca macho 1/4-28 nos orifícios de origem de cada poço do reator. Aparafuse as conexões do adaptador da barra da mangueira Luer fêmea nas conexões de rosca para as conexões de resíduos e fontes de cada poço do reator. Em seguida, aparafuse as conexões do adaptador de farpa de mangueira fêmea Luer X a 3-32/2 polegadas nas conexões de rosca 1/4-28 para as portas de amostra. Coloque um septo de borracha sobre os adaptadores de farpa da mangueira e dobre a parte superior. Em seguida, corte dois conjuntos de tubos E-LFL de 2,06 milímetros para as linhas de resíduos e fontes. Use água quente para amolecer o tubo para facilitar a fixação. Conecte a tubulação às conexões do adaptador de farpa de mangueira Luer X fêmea para 1/8 de polegada para as conexões de fonte e resíduos. Agora fixe um Luer macho com um anel de trava X para um adaptador de farpa de mangueira de 1/8 de polegada encaixado na outra extremidade da tubulação. Aparafuse um adaptador de farpa de mangueira Luer X fêmea para 1/16 de polegada que se encaixa nele. Conecte a tubulação de duas paradas de tamanho apropriado à fonte correspondente e às conexões de resíduos. Em seguida, fixe outro adaptador de farpa de mangueira Luer X fêmea para 1/16 de polegada na outra extremidade da tubulação. Depois de repetir isso para todas as conexões de origem e resíduos, insira uma Luer macho com anel de trava X para conexões adaptadoras de farpa de mangueira de 1/8 de polegada em um pedaço de tubo E-LFL 2. Conecte uma extremidade ao adaptador de farpa de mangueira Luer X fêmea desocupada para mangueira de 1/16 de polegada na extremidade de cada seção de tubulação de duas paradas para todas as peças. Depois de repetir isso para todas as conexões de origem e resíduos, conecte a tubulação E-LFL de 2.06 milímetros para as linhas de origem dos poços do reator um e dois, usando extremidades opostas de um Luer T fêmea. Em seguida, fixe um pedaço de tubo de cinco centímetros com Luer macho com anel de trava X para conexões adaptadoras de 1/8 de polegada em cada extremidade à saída do meio do T, levando a uma segunda junção em T. Agora conecte a tubulação de fonte E-LFL de 2.06 milímetros para o terceiro reator ao lado oposto do segundo T. Conecte outro segmento de tubulação de cinco centímetros com um Luer macho com anel de trava X para adaptador de 1/8 de polegada em uma extremidade e uma Luer fêmea com anel de trava X para adaptador de 1/8 de polegada na outra. Em seguida, conecte um Luer macho com anel de trava X a um adaptador de farpa de mangueira de 1/8 de polegada a uma extremidade de um pedaço de 25 centímetros de tubo E-LFL de 2.06 milímetros. Fixe um adaptador de farpa de mangueira Luer X fêmea para 1/8 de polegada na outra extremidade e tampe com papel alumínio. Para montar a garrafa de coleta de lixo, prenda frouxamente uma tampa de dois orifícios em uma garrafa de dois litros. Insira conexões de rosca macho 1/4-28 em ambos os orifícios da tampa. Em seguida, conecte uma Luer fêmea com adaptador de farpa de mangueira de 1/8 de polegada ao encaixe de rosca macho que não se conecta à tubulação de PTFE pré-conectada na tampa. Conecte um pedaço de cinco centímetros de tubo E-LFL de 2.06 milímetros ao adaptador de farpa de mangueira na garrafa. Conecte um Luer macho com anel de trava X ao adaptador de farpa de mangueira de 1/8 de polegada na outra extremidade da tubulação antes de cobri-la com papel alumínio. Por fim, cubra toda a tampa do frasco com papel alumínio antes de autoclavar a 121 graus Celsius e 15 psi por 45 minutos. Quando a autoclavagem estiver concluída, aperte as conexões e as vedações de alumínio e coloque os reatores em uma câmara anaeróbica por 48 horas antes do uso. Alinhe a matriz do reator dentro da câmara anaeróbica sobre uma placa de agitação magnética ajustada para 1.600 RPM. Em seguida, encaixe a tubulação de duas paradas para as linhas de origem e resíduos nas braçadeiras das bombas peristálticas correspondentes. Trave o clamps no lugar se isso for feito menos de 25 horas antes do uso. Caso contrário, deixe-o solto para reduzir o desgaste da tubulação. Agora remova a tampa de alumínio do frasco de origem. Aparafuse as conexões na Luer macho para conexões de rosca 1/4-28, certificando-se de que essas aberturas estejam conectadas à tubulação interna de PTFE. Remova as tampas de alumínio e conecte um filtro de seringa de 0.22 micrômetro à linha de ventilação de cinco centímetros do frasco de origem e do frasco de resíduos. Inicie o fluxo a uma taxa moderada para começar a encher o reator. Certifique-se de que a tubulação de cintura dentro de cada poço do reator esteja posicionada abaixo da tubulação de origem para evitar o enchimento excessivo ou o esvaziamento completo de cada poço. À medida que os reatores começam a encher, verifique se todos os poços atingem o mesmo volume e se o meio flui para a cintura antes de deixar os reatores para desgaseificar durante a noite. Comece transferindo os materiais experimentais para a câmara anaeróbica por 24 horas. Depois de calcular a quantidade de inóculo fecal necessária, transfira as amostras fecais preservadas em frascos criogênicos para a câmara anaeróbica e deixe-as descongelar por 15 minutos. Com uma ponta de pipeta de furo largo, transfira o material fecal dos frascos criogênicos para um tubo cônico de 50 mililitros. Centrifugar o tubo selado a 200 g durante cinco minutos para assentar as partículas. Transfira os tubos de volta para a câmara anaeróbica. Em seguida, remova o sobrenadante. Use uma espátula de laboratório em autoclave para transferir os 5,7 gramas dos sólidos fecais para um novo tubo cônico de 50 mililitros. Adicione 17,1 mililitros de solução salina anaeróbica estéril ao tubo e feche bem. Agora agite o tubo por cinco minutos antes de centrifugar, conforme demonstrado anteriormente. Use um lenço umedecido de laboratório com alvejante a 10% para esterilizar os septos no topo de cada reator por pelo menos dois minutos. Depois de retornar as amostras à câmara anaeróbica, pipetar o sobrenadante para novos tubos cônicos de 50 mililitros. Agora transfira 3,8 mililitros de sobrenadante de pasta fecal para seis seringas separadas de cinco mililitros equipadas com agulhas de calibre 16 de 1,5 polegadas. Remova o lenço de água sanitária dos septos do reator. Em seguida, insira a agulha no septo e injete lentamente 3,8 mililitros de pasta fecal em cada reator antes de deixar os reatores descansarem durante a noite. Após uma incubação de 16 a 18 horas, inicie o fluxo para o reator. Defina a placa de agitação magnética para a velocidade máxima imediatamente após injetar a pasta fecal. A composição da comunidade microbiana em ambos os reatores replicados mudou ao longo do tempo, com diferentes espécies mostrando abundância relativa variável ao longo dos dias. Bactérias anaeróbias fastidiosas, como o gênero Clostridium, foram consistentemente detectadas em cada reator em todos os momentos.