Name: Imagem de transferência de energia de ressonância de Förster de células vivas da dinâmica de ativação de Akt regulada metabolicamente em células HepG2 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-23T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Aprenda a quantificar a dinâmica espaciotemporal da ativação de Akt em células HepG2 vivas usando imagem FRET. Este protocolo oferece insights sobre vias de sinalização de insulina e regulação metabólica em células cancerígenas.

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<table><tbody><tr><td>0,25% de tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>Gato # 25200-056</td><td>Use PBS gelado para lavagem de células</td></tr><tr><td>Placa de cultura de células com fundo de vidro de 15 mm</td><td>NINHO</td><td>Gato#801001</td><td></td></tr><tr><td>2&nbsp; mL de frascos criogênicos de Nalgene</td><td>Thermo Científico</td><td>Gato#5012-0020</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas sorológicas Stripette de 5 mL</td><td>Corning</td><td>Gato#4487</td><td></td></tr><tr><td>95% de etanol</td><td>Kermel</td><td>Gato#C028005</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal A1 HD25 / A1R HD25</td><td>Nikon</td><td>https://www.nikon.com/</td><td>Ampliação: 40 vezes;, Abertura numérica (NA): 1,30, Tempo de permanência do pixel: 2,4 ms, Tamanho do pixel: 1024</td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Gato#A9393</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Soluções para ciências da vida da VWR</td><td>Gato # N208-10g</td><td></td></tr><tr><td>Corning 25&nbsp; Balões de cultura retangulares cm2</td><td>Corning</td><td>Gato#430639</td><td></td></tr><tr><td>Contador de células automatizado Countess 3</td><td>Thermo Científico</td><td>http://www.thermofisher.com/#AMQAX2000</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas da câmara de contagem de células da condessa</td><td>Thermo Científico</td><td>http://www.thermofisher.com/#C10228</td><td></td></tr><tr><td>Misturadores de vórtice digital</td><td>Thermo Científico</td><td>https://www.thermofisher.com/</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Gato#D2650</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Tubos de Safe-Lock 1.5&nbsp; Ml</td><td>Eppendorf</td><td>Gato#022363204</td><td></td></tr><tr><td>Kit de detecção de micoplasma EZ-PCR</td><td>Indústrias Biológicas</td><td>Gato # 20-700-20</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino, qualificado, Austrália</td><td>Gibco</td><td>Gato#10099141</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>Gato#35050061</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prisma 9</td><td>GraphPad Software</td><td>https://www.graphpad.com/</td><td></td></tr><tr><td>HepG2</td><td>Coleção Nacional de Culturas de Células Autenticadas</td><td>#CSTR:19375.09.3101HUMSCSP510&nbsp; http://www.cellbank.org.cn/</td><td></td></tr><tr><td>Óleo de imersão tipo 37</td><td>Laboratórios Cargille</td><td>Gato #16237</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Gato # I5500-50MG</td><td>Quente para 37 & graus; C antes de usar</td></tr><tr><td>Caldo LB (1x)</td><td>Invitrogen</td><td>Gato#10855001</td><td></td></tr><tr><td>Meio essencial mínimo (MEM)</td><td>Gibco</td><td>Gato#11095080</td><td>Quente para 37 & graus; C antes de usar</td></tr><tr><td>mySPIN 12&nbsp; mini centrífuga</td><td>Thermo Científico</td><td>https://www.thermofisher.com/</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop Um</td><td>Thermo Científico</td><td>https://www.thermofisher.com</td><td></td></tr><tr><td>Lente a Óleo Nikon Plan Fluor 40&vezes;/1.30</td><td>Nikon</td><td>https://www.nikon.com/</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elementos-AR</td><td>Nikon</td><td>https://www.nikon.com/</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos não essenciais (NEAA) (100x)</td><td>Gibco</td><td>Gato#11140050</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Ágar One Shot LB&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Gato#A55802</td><td></td></tr><tr><td>One Shot Stbl3 quimicamente competente E.&nbsp; Coli</td><td>Invitrogen</td><td>Gato#C737303</td><td></td></tr><tr><td>Parafilme</td><td>PARAFILME</td><td>Gato#B8R05606</td><td></td></tr><tr><td>PBS (solução salina tamponada com fosfato)</td><td>Gibco</td><td>Gato#10010023</td><td></td></tr><tr><td>pEevee-iAkt-NES (7.033&nbsp; bp)</td><td>Miura et&nbsp; al31</td><td>https://benchling.com/s/seq-q46zFYCfl0swLAun0t28/edit</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>Gato#15070063</td><td></td></tr><tr><td>Plasmocina profilática</td><td>InvivoGen</td><td>Gato#ant-mpp</td><td></td></tr><tr><td>Bromidrato de Poli-L-Lisina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Gato#P4832</td><td></td></tr><tr><td>Banhos de uso geral de precisão</td><td>Thermo Científico</td><td>https://www.thermofisher.com/</td><td></td></tr><tr><td>Kit miniprep de rotação QIAprep</td><td>QIAGEN</td><td>Gato#27106</td><td></td></tr><tr><td>SnapGene</td><td>SnapGene da Dotmatics</td><td>https://www.snapgene.com</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sódio (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>Gato#11360070</td><td></td></tr><tr><td>Unidade de filtro de seringa, 0.22&nbsp; &mu; m</td><td>Millipore</td><td>Gato#SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora Tokai Hit stage top</td><td>TOKAI HIT</td><td>https://www.tokaihit-livecell.com/stagetopincubator</td><td></td></tr><tr><td>Água destilada sem DNase/RNase ultrapura</td><td>Invitrogen</td><td>Gato#10977015</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de transfecção Xfect</td><td>Biografia de Takara</td><td>Gato#631317</td><td></td></tr></tbody></table>

imagem de transferência de energia de ressonância de förster de células vivas da dinâmica de ativação de akt regulada metabolicamente em células hepg2

Live-Cell F&#246;rster Resonance Energy Transfer Imaging of Metabolically Regulated Akt Activation Dynamics in HepG2 Cells

Para investigar a ativação de Akt em células HepG2, as células foram semeadas em placas de imagem pré-revestidas e transfectadas com o biossensor baseado em FREST pEevee-iAkt-NES (Figura 2A), projetado para permitir o monitoramento em tempo real da fosforilação de Akt. Após a transfecção, as células foram submetidas à falta de soro por 4 h em meio livre de soro para sincronizar seu estado metabólico e minimizar a sinalização basal da insulina.
As células foram pos...

Imagem de transferência de energia de ressonância de Förster de células vivas da dinâmica de ativação de Akt regulada metabolicamente em células HepG2

Metabolically regulated Akt activation is a critical node in the insulin signaling cascade and provides valuable insights into the relationship between ...

A heterogeneidade celular é um obstáculo para a descrição precisa dos meandros da dinâmica celular, que são essencialmente calculados em média. É por isso que estamos aqui para obter imagens de células únicas. Desenvolvimentos recentes em biossensores FRET geneticamente codificados melhoraram a especificidade e revolucionaram o rastreamento em tempo real de Akt dentro das células, o que é fundamental para a compreensão heterogenética e o desenvolvimento de terapias medicamentosas personalizadas.O câncer e o diabetes são através de vias metabólicas complexas. Para decodificar a biocomplexidade da via de sinalização da insulina no câncer, usamos imagens FRET de células vivas de ponta com resolução de célula única. Descobrimos que otimizar o microscópio confocal, a configuração de hardware e software, juntamente com o ajuste fino da potência do laser e o ajuste do ganho do detector, são essenciais para minimizar qualquer ruído e diafonia espectral nos sinais FRET.Os métodos tradicionais em massa, como o western blotting, carecem de detalhes espaciais temporais e mascaram a heterogeneidade celular. Nosso protocolo preenche essa lacuna usando imagens FRET de células vivas para capturar a resposta celular com alta precisão e exatidão. Para começar, adicione um mililitro de uma solução de poli-L-lisina de 0,1 miligrama por mililitro a uma placa de imagem e balance a placa para cobrir toda a superfície.Após a incubação durante a noite, aspire o excesso de solução de poli-L-lisina do prato. Enxágue suavemente a superfície com PBS 3 vezes, descansando por cinco minutos cada para remover completamente a poli-L-lisina não ligada. Aspire o PBS e seque ao ar o prato de imagem revestido a 37 graus Celsius por pelo menos três horas.Em seguida, semeie as células HepG2 na placa de imagem pré-revestida 24 a 48 horas antes da transfecção para garantir que atinjam 70 a 90% de confluência. Descongele e vortex o reagente de transfecção junto com o plasmídeo que codifica o biossensor de transferência de energia de ressonância Forster. Faça uma pequena centrifugação para coletar toda a mistura no fundo do tubo.Misture oito microgramas do plasmídeo com o tampão de reação até um volume final de 100 microlitros usando um vórtice por cinco segundos em alta velocidade. Faça uma pequena centrifugação para coletar a mistura no fundo do tubo. Adicione 2,4 microlitros do polímero de transfecção ao tubo que contém o DNA plasmático diluído e misture bem.Incube o biossensor e a mistura de polímeros a 37 graus Celsius por 15 minutos para permitir a formação de complexos de nanopartículas. Gire o tubo por cinco segundos a 5.000 G para coletar o conteúdo na parte inferior. Adicione todos os 100 microlitros de solução complexa de nanopartículas gota a gota ao meio de cultura de células e balance suavemente a placa para frente e para trás para misturar.Incube a placa a 37 graus Celsius por quatro horas durante a noite. Depois de remover os complexos de nanopartículas das células, substitua a solução por dois mililitros de meio de crescimento completo fresco. Retorne a placa para a incubadora de 37 graus Celsius até o momento da análise.Analise as células sob microscopia de fluorescência. Remova o meio de cultura do prato de imagem e enxágue o prato duas vezes com 1X PBS, permitindo que cada enxágue dure cinco minutos. Adicione dois mililitros de meio de fome a cada prato ao redor da borda do prato.Incube as células a 37 graus Celsius por quatro horas. Em seguida, ligue o computador e, em seguida, ligue a unidade principal do microscópio confocal e os acessórios sequencialmente. Depois disso, ative o sistema de laser girando a chave para a posição ligada e girando as chaves seletoras de lançamento do laser.Em seguida, gire os interruptores de trava do laser no sentido horário para a posição ligada para ambas as linhas de laser. Por fim, ligue a alimentação do controlador do sistema. Inicie o software NIS-Elements AR a partir da área de trabalho.Clique em A1 para aquisição para iniciar a configuração da imagem e selecionar as configurações ópticas apropriadas com base nos requisitos experimentais. Instale a incubadora superior do estágio do microscópio e prenda-a com parafusos. Encha o banho-maria interno com água estéril e bidestiladaEm seguida, instale o aquecedor superior e ligue a fonte de alimentação do stage aquecedor, aquecedor de banho e aquecedor de lente. Limpe a lente de imersão em óleo 40X com papel de lente umedecido com etanol 95% e coloque uma pequena gota de óleo de imersão na lente objetiva. Em seguida, posicione a placa de imagem contendo as células HepG2 no microscópio stage e prenda-o com o suporte.Feche a câmara e incube as células por uma a duas horas para permitir o equilíbrio. Inicie a janela de aquisição ND no menu File do NIS-Elements AR. Selecione a guia Tempo para definir o intervalo, a duração e os loops para imagens de lapso de tempo. Clique na guia XY e pressione o botão Adicionar para incluir células HepG2 para imagens sob foco.Em seguida, marque a caixa Z para definir a posição Z. Clique em Procurar para selecionar uma pasta de destino. Insira o nome do experimento na caixa Nome do arquivo.Clique em Executar agora para iniciar a aquisição e iniciar o processo de geração de imagens com lapso de tempo. Registre as medições basais por até 30 minutos sem mídia suplementada com insulina. Pause a imagem em intervalos regulares.Remova suavemente o meio do prato com fundo de vidro e adicione um mililitro de meio suplementado com a concentração de insulina apropriada. Retome a aquisição da imagem e clique em Concluir no final do experimento para fechar. Por fim, faça backup e armazene com segurança as imagens adquiridas para análise.Um aumento dependente da dose na fosforilação de Akt foi observado após a estimulação da insulina, com um aumento acentuado ocorrendo em 300 insulina picomolar. Além dessa concentração, os níveis de fosforilação se estabilizaram e não diminuíram mesmo após a diminuição da insulina. A razão FRET normalizada mostrou uma tendência semelhante, com um sinal crescente após a estimulação da insulina e falha em retornar à linha de base após a retirada da insulina.Após a estimulação sequencial da insulina, foi observado um aumento progressivo na razão FRET normalizada, apoiando a resposta de ativação da Akt dependente da dose.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

FRET baseado jornalistas estão cada vez mais utilizados para monitorar atividades quinase e fosfatase em células vivas. Aqui nós descrevemos um método de como usar FRET baseado jornalistas para avaliar o ciclo de dependentes de células alterações na fosforilação alvo.

Atividades de monitoramento quinases e fosfatases através do ciclo celular por raciométrica FRET

Leucina repetição rica quinases 1 e 2 (e LRRK1 LRRK2) são proteínas de vários domínios que codificam tanto GTPase e domínios cinase e que são fosforiladas em células. Aqui, apresentamos um protocolo para rotular LRRK1 e LRRK2 em células com 32 P-ortofosfato, proporcionando assim um meio para medir seus níveis gerais de fosforilação celular.

Metabólica Rotulagem de Leucina rico Repita Kinases 1 e 2 com Radioactive Fosfato

MRP4 regula vários eventos de sinalização dependentes de nucleótidos cíclicos, incluindo um papel recentemente elucidados na migração de células. Nós descrevemos uma abordagem direta, mas multifacetada para desvendar os alvos moleculares jusante de MRP4 resultando em identificação de um interactome MRP4 única que desempenha um papel-chave na regulação afinado da migração de fibroblastos.

Métodos para estudar MRP4 contendo Complexos Macromoleculares no regulamento de Fibroblasto Migração

Aqui apresentamos um protocolo para células de imagens que expressam receptores verdes fluorescentes marcado com proteína de tipo angiotensina 1a durante a endocitose iniciadas por tratamento angiotensina II. Esta técnica inclui lisossomas rotulagem com um segundo marcador fluorescente, e em seguida, utilizando software para analisar a co-localização do receptor e lisossoma em três dimensões ao longo do tempo.

Imagens de células vivas e Análise 3D da angiotensina Receptor Tipo Tráfico 1a em células do rim Transfectados embrionárias humanas usando microscopia confocal

O laser de femtossegundo firmemente-focalizado pode entregar a estimulação precisa às pilhas acoplando em uma microscopia confocal permitindo a observação e a fotoestimulação tempo real. A fotoestimulação pode ativar eventos moleculares celulares, incluindo via de sinalização ERK e flashes mitocondriais de espécies reativas de oxigênio.

Fotoestimulação por Femtosecond laser ativa extracellular-sinal-regulado quinase (ERK) sinalização ou eventos mitocondrial em células-alvo

As células progenitoras de tronco hematopoiético (HSPCs) transitam de um estado quiescente para um estado de diferenciação devido à sua plasticidade metabólica durante a formação sanguínea. Aqui, apresentamos um método otimizado para medir a respiração mitocondrial e a glicolíse dos HSPCs.

Análise do metabolismo hematopoiético da pilha do progenitor da haste

Os protocolos de ensaio baseados em células de ressonância Förster são descritos para a quantificação simples, específica, sensível e robusta do transdutor de sinal endogenso e ativador de transcrição (STAT) 1/3/4/5/6 em lises celulares em um formato de 384 poços.

Ensaios de transferência de energia de ressonância de Förster para medição de proteínas STAT fosforilatos endogensas em células humanas

O ensaio de fluxo metabólico celular em tempo real mede a taxa de consumo de oxigênio e a taxa de acidificação extracelular, que corresponde à produção de triptosfato de adenosina mitocondrial e glicolítico, usando sensores de pH e oxigênio. O manuscrito explica um método para compreender o estado energético dos osteoblastos e a caracterização e interpretação do estado bioenergéstico celular.

Usando o analisador de fluxo metabólico de células em tempo real para monitorar bioenergetics osteoblast

Este protocolo descreve imagens de fluorescência e análise das aconzyomas metabólicas endógenas, dinucleotídeos de nicotinamida reduzida (fosfato) dinucleotídeos (NAD(P)H) e dinucleotídeo de adenina de flavina oxidada (FAD). A imagem de autofluorescência de NAD(P)H e FAD fornece um método sem rótulos e não destrutivo para avaliar o metabolismo celular.

Imagem de autofluorescência para avaliar o metabolismo celular

Apresentamos um protocolo para visualizar diretamente as atividades metabólicas em células reguladas por aminoácidos usando microscopia Raman estimulada de espalhamento Raman estimulado com óxido de deutério (água pesada D2O) (DO-SRS), que é integrada à microscopia de fluorescência por excitação de dois fótons (2PEF).

Imagem Química Bioortogonal do Metabolismo Celular Regulado por Aminoácidos Aromáticos

Este protocolo integra um sistema de biorreator personalizado com espectroscopia de RMN ¹³C hiperpolarizada para medir o metabolismo do piruvato em tempo real em células vivas, melhorando a reprodutibilidade e a precisão cinética para estudos metabólicos e aplicações de triagem de medicamentos.

Detecção metabólica em tempo real em células vivas usando RMN hiperpolarizada de 13C

Aprenda a quantificar a dinâmica espaciotemporal da ativação de Akt em células HepG2 vivas usando imagem FRET. Este protocolo oferece insights sobre vias de sinalização de insulina e regulação metabólica em células cancerígenas.

Imagem de transferência de energia de ressonância de Förster de células vivas da dinâmica de ativação de Akt regulada metabolicamente em células HepG2 (Vídeo) | JoVE Journal

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