Uma abordagem simplificada para proteômica baseada em espectrometria de massa usando regiões de tecido selecionadas

Desenvolvemos um método simplificado para estudar o proteoma em regiões específicas de amostras de tecido superior usando espectrometria de massa. Nosso objetivo é aprimorar a técnica proteômica, incluindo preparação de amostras e análise de espectrometria de massa, para obter alta precisão e confiabilidade. Um desafio na proteômica espacial baseada em FFPE é a digestão incompleta de proteínas, o que reduz a cobertura geral de proteínas.

Superá-los requer protocolos de digestão otimizados e estratégias aprimoradas de espectrometria de massa para melhorar as profundidades e a precisão do proteoma. Identificamos alterações proteicas distintas em diferentes tipos de doenças pancreáticas, fornecendo informações sobre as diferenças entre condições benignas e pré-cancerosas. Esses achados podem auxiliar no diagnóstico precoce do câncer de pâncreas.

Nosso objetivo é avançar o método de proteinase do paciente para obter um mapeamento de proteínas de alta resolução nas regiões do tecido. Utilizando proteômica baseada em espectrometria de massa, procuramos identificar assinaturas moleculares específicas da região que contribuem para a descoberta de biomarcadores. Nossa abordagem integra essas armadilhas e pré-preparação do paciente com espectrometria de massa de ocasião independente de dados para gerar rapidamente dados de proteoma de alta qualidade a partir de regiões de tecido FFPE selecionadas.

Este método permite uma grande quantificação do proteoma espacial. Para começar, prepare uma lâmina de tecido corada com hematoxilina e eosina ou imuno-histoquímica com a região de interesse indicada por um patologista. Coloque a lâmina de tecido não corado e a lâmina de tecido manchado de costas para trás, garantindo o alinhamento adequado.

Usando um bisturi, remova as regiões de tecido que não são de interesse e raspe as regiões de tecido de interesse em direção ao centro da lâmina. Transfira o tecido coletado para um tubo limpo de 1,5 mililitro de baixa ligação a proteínas e adicione 180 microlitros de tampão de lise SDS a cada tubo. Execute a sonicação da sonda a 20% de amplitude por 10 ciclos de cinco segundos ligado e cinco segundos desligado.

Agora, incube as amostras a 100 graus Celsius por 3,5 horas, mantendo uma velocidade de 1.000 G. Após a incubação, deixe a amostra esfriar em temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida, centrifugue a 16.000 G por 10 minutos em temperatura ambiente para separar os detritos teciduais do sobrenadante. Recolha o sobrenadante num tubo limpo e rotulado e guarde a 80 graus Celsius negativos até à sua nova utilização.

Para precipitação de acetona, colocar a amostra de proteína correspondente a 100 a 300 microgramas num tubo compatível com acetona. Em seguida, adicione acetona gelada, pré-resfriada a menos 20 graus Celsius, em um volume cinco vezes maior que o volume da amostra. Incube a mistura a menos 20 graus Celsius por 18 horas.

Após a incubação, centrifugar o tubo a 16 000 g durante 15 minutos. Descarte cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet de proteína. Adicione 500 microlitros de acetona temperada a menos 20 graus Celsius e centrifugue.

Após a decantação do sobrenadante, secar a amostra ao ar. Preparar o tampão de lise de retenção em suspensão em água desionizada. Em seguida, adicione 40 microlitros do tampão preparado ao tubo de amostra e vórtice completamente para dissolver o pellet de proteína seco ao ar.

Colocar a amostra numa incubadora agitada a 100 graus Celsius a 1 000 g durante 35 minutos. Em seguida, adicione 10 microlitros do reagente alquilante à amostra e incube a amostra em temperatura ambiente a 300 G por uma hora. Dentro de uma capela de exaustão química, adicione cinco microlitros de ácido tricloroacético a 10% à amostra, perfazendo o volume total de 55 microlitros.

Verifique o pH da amostra usando papel de pH para garantir que seja menor que um. Em seguida, adicione 350 microlitros de tampão de ligação um à amostra para capturar proteínas. Colocar a coluna de retenção em suspensão num tubo de dois mililitros e transferir toda a amostra, incluindo qualquer material insolúvel, para a coluna.

Centrifugar a coluna a 4 000 G durante 50 segundos para reter as proteínas. Em seguida, adicione 400 microlitros de tampão de lavagem dois. Após a centrifugação, descarte o fluxo.

Após a lavagem final, centrifugue a coluna a 4.000 G por 1,25 minutos para garantir a passagem completa do tampão um. Adicione 125 microlitros de tampão de digestão à coluna de retenção de suspensão e tampe-a para evitar a evaporação. Incubar a amostra a 37 graus Celsius por 18 horas sem agitar.

Agora, adicione 80 microlitros de tampão de eluição um à coluna de retenção em suspensão e centrifugue a 4.000 G por 1,25 minutos. Puxe os peptídeos eluídos e transfira-os para um novo tubo limpo. Após a quantificação dos peptídeos, liofilize 20 microgramas de peptídeos.

Dissolva novamente os peptídeos liofilizados em 40 microlitros de tampão aquoso contendo 3% de acetonitrila em água com ácido fórmico a 0,1% e sonice por 10 minutos em um banho de sonicação. Centrifugar a amostra a 16 000 g durante 60 minutos e transferir o sobrenadante para frascos para análise por espectrometria de massa. Injete dois microlitros de cada amostra usando o amostrador automático do sistema de espectrometria de massa de cromatografia nanolíquida.

Separe os peptídeos em uma coluna de fase reversa embalada com material C18 de três micrômetros usando um gradiente de 127 minutos de cinco a 35% de acetonitrila a 100 nanolitros por minuto. Ionize os peptídeos por meio de uma fonte de íons de nanospray e transfira-os para um espectrômetro de massa baseado em Orbitrap. Analise peptídeos usando um método de aquisição independente de dados de faixa estreita.

O isolamento preciso da região de interesse durante o processamento de tecidos FFPE foi obtido em diferentes tecidos pancreáticos císticos fixados em formalina e embebidos em parafina. Foram obtidos cromatogramas de íons totais reprodutíveis entre trirreplicados biológicos para cada tipo de neoplasia cística pancreática. A análise de espectrometria de massa por cromatografia líquida identificou 9.703 proteínas.

As abundâncias de todas as proteínas identificadas abrangeram 6,25 ordens de magnitude, demonstrando uma cobertura abrangente do proteoma, e marcadores conhecidos de proteínas do câncer de pâncreas foram quantificados. Um total de 933 proteínas diferencialmente expressas foram identificadas, com 457 reguladas positivamente e 476 reguladas negativamente em neoplasias mucinosas papilares intraductais. A análise de bioinformática revelou que proteínas diferencialmente expressas estavam associadas a várias vias relacionadas ao câncer de pâncreas.