Uma abordagem simplificada para proteômica baseada em espectrometria de massa usando regiões de tecido selecionadas
18 de abril de 2025
Aqui, estabelecemos um método proteômico baseado em espectrometria de massa usando regiões isoladas de interesse em seções de tecido fixadas em formalina e embebidas em parafina. Este protocolo é usado para analisar o proteoma de áreas específicas do tecido em seções de tecido arquivadas fixadas em formalina e embebidas em parafina.
Desenvolvemos um método simplificado para estudar o proteoma em regiões específicas de amostras de tecido superior usando espectrometria de massa. Nosso objetivo é aprimorar a técnica proteômica, incluindo preparação de amostras e análise de espectrometria de massa, para obter alta precisão e confiabilidade. Um desafio na proteômica espacial baseada em FFPE é a digestão incompleta de proteínas, o que reduz a cobertura geral de proteínas.
Superá-los requer protocolos de digestão otimizados e estratégias aprimoradas de espectrometria de massa para melhorar as profundidades e a precisão do proteoma. Identificamos alterações proteicas distintas em diferentes tipos de doenças pancreáticas, fornecendo informações sobre as diferenças entre condições benignas e pré-cancerosas. Esses achados podem auxiliar no diagnóstico precoce do câncer de pâncreas.
Nosso objetivo é avançar o método de proteinase do paciente para obter um mapeamento de proteínas de alta resolução nas regiões do tecido. Utilizando proteômica baseada em espectrometria de massa, procuramos identificar assinaturas moleculares específicas da região que contribuem para a descoberta de biomarcadores. Nossa abordagem integra essas armadilhas e pré-preparação do paciente com espectrometria de massa de ocasião independente de dados para gerar rapidamente dados de proteoma de alta qualidade a partir de regiões de tecido FFPE selecionadas.
Este método permite uma grande quantificação do proteoma espacial. Para começar, prepare uma lâmina de tecido corada com hematoxilina e eosina ou imuno-histoquímica com a região de interesse indicada por um patologista. Coloque a lâmina de tecido não corado e a lâmina de tecido manchado de costas para trás, garantindo o alinhamento adequado.
Usando um bisturi, remova as regiões de tecido que não são de interesse e raspe as regiões de tecido de interesse em direção ao centro da lâmina. Transfira o tecido coletado para um tubo limpo de 1,5 mililitro de baixa ligação a proteínas e adicione 180 microlitros de tampão de lise SDS a cada tubo. Execute a sonicação da sonda a 20% de amplitude por 10 ciclos de cinco segundos ligado e cinco segundos desligado.
Agora, incube as amostras a 100 graus Celsius por 3,5 horas, mantendo uma velocidade de 1.000 G. Após a incubação, deixe a amostra esfriar em temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida, centrifugue a 16.000 G por 10 minutos em temperatura ambiente para separar os detritos teciduais do sobrenadante. Recolha o sobrenadante num tubo limpo e rotulado e guarde a 80 graus Celsius negativos até à sua nova utilização.
Para precipitação de acetona, colocar a amostra de proteína correspondente a 100 a 300 microgramas num tubo compatível com acetona. Em seguida, adicione acetona gelada, pré-resfriada a menos 20 graus Celsius, em um volume cinco vezes maior que o volume da amostra. Incube a mistura a menos 20 graus Celsius por 18 horas.
Após a incubação, centrifugar o tubo a 16 000 g durante 15 minutos. Descarte cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet de proteína. Adicione 500 microlitros de acetona temperada a menos 20 graus Celsius e centrifugue.
Após a decantação do sobrenadante, secar a amostra ao ar. Preparar o tampão de lise de retenção em suspensão em água desionizada. Em seguida, adicione 40 microlitros do tampão preparado ao tubo de amostra e vórtice completamente para dissolver o pellet de proteína seco ao ar.
Colocar a amostra numa incubadora agitada a 100 graus Celsius a 1 000 g durante 35 minutos. Em seguida, adicione 10 microlitros do reagente alquilante à amostra e incube a amostra em temperatura ambiente a 300 G por uma hora. Dentro de uma capela de exaustão química, adicione cinco microlitros de ácido tricloroacético a 10% à amostra, perfazendo o volume total de 55 microlitros.
Verifique o pH da amostra usando papel de pH para garantir que seja menor que um. Em seguida, adicione 350 microlitros de tampão de ligação um à amostra para capturar proteínas. Colocar a coluna de retenção em suspensão num tubo de dois mililitros e transferir toda a amostra, incluindo qualquer material insolúvel, para a coluna.
Centrifugar a coluna a 4 000 G durante 50 segundos para reter as proteínas. Em seguida, adicione 400 microlitros de tampão de lavagem dois. Após a centrifugação, descarte o fluxo.
Após a lavagem final, centrifugue a coluna a 4.000 G por 1,25 minutos para garantir a passagem completa do tampão um. Adicione 125 microlitros de tampão de digestão à coluna de retenção de suspensão e tampe-a para evitar a evaporação. Incubar a amostra a 37 graus Celsius por 18 horas sem agitar.
Agora, adicione 80 microlitros de tampão de eluição um à coluna de retenção em suspensão e centrifugue a 4.000 G por 1,25 minutos. Puxe os peptídeos eluídos e transfira-os para um novo tubo limpo. Após a quantificação dos peptídeos, liofilize 20 microgramas de peptídeos.
Dissolva novamente os peptídeos liofilizados em 40 microlitros de tampão aquoso contendo 3% de acetonitrila em água com ácido fórmico a 0,1% e sonice por 10 minutos em um banho de sonicação. Centrifugar a amostra a 16 000 g durante 60 minutos e transferir o sobrenadante para frascos para análise por espectrometria de massa. Injete dois microlitros de cada amostra usando o amostrador automático do sistema de espectrometria de massa de cromatografia nanolíquida.
Separe os peptídeos em uma coluna de fase reversa embalada com material C18 de três micrômetros usando um gradiente de 127 minutos de cinco a 35% de acetonitrila a 100 nanolitros por minuto. Ionize os peptídeos por meio de uma fonte de íons de nanospray e transfira-os para um espectrômetro de massa baseado em Orbitrap. Analise peptídeos usando um método de aquisição independente de dados de faixa estreita.
O isolamento preciso da região de interesse durante o processamento de tecidos FFPE foi obtido em diferentes tecidos pancreáticos císticos fixados em formalina e embebidos em parafina. Foram obtidos cromatogramas de íons totais reprodutíveis entre trirreplicados biológicos para cada tipo de neoplasia cística pancreática. A análise de espectrometria de massa por cromatografia líquida identificou 9.703 proteínas.
As abundâncias de todas as proteínas identificadas abrangeram 6,25 ordens de magnitude, demonstrando uma cobertura abrangente do proteoma, e marcadores conhecidos de proteínas do câncer de pâncreas foram quantificados. Um total de 933 proteínas diferencialmente expressas foram identificadas, com 457 reguladas positivamente e 476 reguladas negativamente em neoplasias mucinosas papilares intraductais. A análise de bioinformática revelou que proteínas diferencialmente expressas estavam associadas a várias vias relacionadas ao câncer de pâncreas.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um método proteômico baseado em espectrometria de massas para analisar regiões específicas de interesse em cortes de tecido fixado em formalina e emblocado em parafina. O protocolo tem como objetivo aumentar a precisão e a confiabilidade da análise proteômica em amostras de tecido arquivadas.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Proteômica
- Espectrometria de Massa
- Patologia
Antecedentes
- Tecidos fixados em formalina e embutidos em parafina (FFPE) são comumente utilizados em pesquisas.
- O estudo do proteoma em regiões específicas de tecidos pode fornecer informações sobre os mecanismos das doenças.
- Os desafios incluem digestão incompleta das proteínas, afetando a cobertura proteica.
- São necessários protocolos otimizados para uma análise precisa.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método simplificado para análise proteômica em regiões específicas do tecido.
- Aprimorar as técnicas de preparação de amostras e espectrometria de massas.
- Identificar alterações proteicas em doenças pancreáticas.
Métodos Utilizados
- Espectrometria de massas para análise proteômica.
- Isolamento de regiões específicas de tecido de amostras FFPE.
- Protocolos de digestão otimizados para análise de proteínas.
- Análise comparativa de alterações proteicas em condições pancreáticas.
Resultados Principais
- Foram identificadas alterações proteicas distintas em diferentes tipos de doenças pancreáticas.
- Obteve-se uma melhor compreensão das diferenças entre condições benignas e pré-cancerosas.
- O método aprimora a profundidade e a precisão da análise proteômica.
- Os achados podem auxiliar no diagnóstico precoce do câncer de pâncreas.
Conclusões
- O método desenvolvido melhora o estudo de proteomas em tecidos FFPE.
- Protocolos otimizados podem superar desafios na digestão de proteínas.
- Esta pesquisa contribui para a compreensão das doenças pancreáticas e aplicações diagnósticas potenciais.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Proteômica com resolução espacial utilizando regiões de tecido FFPE atende à necessidade crítica de perfilagem molecular de alta resolução em pesquisas oncológicas na fase de descoberta. Este fluxo de trabalho simplificado permite a quantificação robusta e a análise comparativa da expressão proteica em microambientes teciduais relevantes para a doença, apoiando a confiança preditiva na validação precoce de biomarcadores e alvos terapêuticos. A integração da seleção de regiões orientada por patologistas com o preparo otimizado de amostras e análise em massa por espectrometria de massa (MS) de alto rendimento melhora a tomada de decisões em portfólios na interface entre pesquisa de descoberta e pesquisa translacional.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação de alterações proteômicas específicas de região em contextos de tecido doente e benigno.
- Apoia a validação funcional de alvos mediante a quantificação de marcadores proteicos conhecidos e novos in loco.
- Facilita a redução de riscos mecanicistas por meio da análise em nível de vias de proteínas diferencialmente expressas.
- Aprimora a confiança preditiva na descoberta de biomarcadores e no triagem inicial de alvos candidatos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prepara amostras de tecido validadas e espacialmente definidas para fluxos de trabalho proteômicos quantitativos subsequentes.
- Padroniza a preparação das amostras e a análise por espectrometria de massas para garantir reprodutibilidade e escalabilidade entre estudos.
- Gera dados proteômicos quantitativos de alta qualidade adequados para triagem comparativa de estados patológicos.
- Permite avaliação confiável de alterações na expressão proteica para desenvolvimento e otimização de ensaios.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha descobertas moleculares de tecidos FFPE com vias relevantes para a doença implicadas na progressão do câncer.
- Proporciona continuidade do perfil proteômico em estágio de descoberta até a validação em modelos pré-clínicos.
- Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco ao vincular assinaturas moleculares a fenótipos clínicos.
- Aprimora o alinhamento de biomarcadores translacionais por meio da quantificação abrangente de proteínas em tecidos arquivados.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo integrado conecta a descoberta inicial, a validação de alvos e a pesquisa translacional ao permitir a análise proteômica com resolução espacial de tecidos FFPE.
- Biologia da Descoberta: Facilita a testagem de hipóteses e a clarificação de vias ao quantificar a expressão proteica específica de regiões.
- Triagem: Fornece resultados quantitativos reprodutíveis para comparação robusta entre regiões de tecidos de doença e controle.
- Análises: Oferece medidas abrangentes de abundância proteica e análise de expressão diferencial entre condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta assinaturas proteômicas a mecanismos de doenças e possíveis biomarcadores clínicos.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um fluxo de trabalho padronizado e escalável para uso repetido em diversos tipos de tecidos e modelos de doenças.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos e biomarcadores.
- Valor Operacional: Otimiza a preparação de amostras, melhora a reprodutibilidade e permite escalabilidade de alto rendimento.
- Valor Estratégico: Aprimora as decisões de prosseguir ou interromper projetos e a eficiência do capital ao permitir um perfil molecular robusto já nos estágios iniciais do processo.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização e o avanço ajustados ao risco de programas de descoberta e translacionais.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em macrodissecção de tecidos, preparação de amostras para proteômica e operação de espectrometria de massas.
- Exige acesso a instrumentação de MS de alta resolução e infraestrutura bioinformática robusta.
- Necessita padronização entre equipes para seleção de regiões e protocolos de análise de dados.
- Adaptável a diversos tipos de tecidos FFPE e modelos de doenças com otimização apropriada.
- Limitações potenciais incluem variabilidade na recuperação de proteínas e a necessidade de colaboração com patologistas para identificação das regiões de interesse (ROI).
