Geração e caracterização de astrócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos sem ribonucleoproteína mensageira X frágil

Este trabalho se concentra em quatro astrócitos humanos específicos do cérebro e como eles são alterados por distúrbios do neurodesenvolvimento, como a síndrome do X frágil. Trabalhos anteriores usaram modelos animais para estudar principalmente neurônios, então este trabalho adiciona uma nova dimensão a essa área de pesquisa.

Insights mecanicistas de estudos com animais tiveram sucesso clínico limitado. O maior desafio é obter insights semelhantes sobre neurônios e astrócitos de origem humana.

Nosso protocolo gerou com sucesso astrócitos funcionais específicos do vento, que exibem metabolismo desregulado, glicolítico e mitocondrial na síndrome do X frágil, permitindo investigações sobre o papel das células gliais na biologia da doença. Apesar das crescentes evidências sobre o papel fundamental da glial na função neuronal na saúde e na doença, pouco se sabe sobre como os astrócitos humanos são afetados em distúrbios do neurodesenvolvimento, como a síndrome do X frágil.

Olhando para o futuro, vamos construir sobre essa estrutura para estudar como os astrócitos e suas interações com os neurônios são alterados pela doença e, em seguida, como eles podem ser corrigidos por intervenções terapêuticas.

[Instrutor] Para começar, cubra um prato de seis inchaços com Matrigel diluído na proporção de um para 60 em DMMF 12 avançado. Armazene o prato revestido a uma temperatura de dois a oito graus Celsius. No dia da cultura, remova o material de revestimento do prato e adicione um mililitro de oito meios essenciais completos, juntamente com um inibidor de rocha na concentração final de um X. Coloque o prato dentro de uma incubadora. Defina a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono antes de adicionar as células-tronco pluripotentes induzidas por humanos, ou IPSCs. Semeie as IPSCs humanas em um meio essencial completo com o inibidor de rocha a uma concentração final de um X para aumentar a adesão da colônia. No dia seguinte, substitua o meio essencial completo por meio novo, sem o inibidor de rocha. Continue reabastecendo o meio diariamente até que as células atinjam 80% de confluência, o que leva aproximadamente quatro a cinco dias. Quando as colônias atingirem 80% de confluência, adicione uma mistura de colagenase e dispase para destacá-las enzimaticamente do prato. Assim que as colônias começarem a se levantar, remova o prato da incubadora e adicione dois mililitros de DPBS para neutralizar a atividade enzimática. Com a PPBS, raspar as colónias e recolher a suspensão para um tubo cónico de 15 ml, utilizando uma pipeta serológica larga de 10 ml. Em seguida, com uma pipeta sorológica de 10 mililitros, triture suavemente a suspensão duas a três vezes para quebrar as colônias. Permita que as colônias se estabeleçam. Após aproximadamente dois minutos, aspire a mistura enzimática DPBS, deixando aproximadamente um mililitro de líquido no tubo. Em seguida, adicione dois mililitros de DPBS ao tubo e misture batendo suavemente para ressuspender as colônias. Deixe-os assentar e repita esse processo duas vezes para remover a enzima residual. Depois de remover o sobrenadante, ressuspenda as colônias em um mililitro de oito meios essenciais completos e coloque-as em um prato revestido de Matrigel recém-preparado. Levante enzimaticamente as células-tronco pluripotentes induzidas por humanos, conforme descrito anteriormente. Coloque-os em uma placa de cultura em suspensão de 100 milímetros não aderente com meio quimicamente definido. Colocar a suspensão celular num agitador orbital a 40 rotações por minuto durante sete dias em condições normóxicas para facilitar o desenvolvimento de esferas corticológicas. No oitavo dia, transfira as esferas de corticoterapia para um meio de proliferação celular e mantenha-as por sete dias. Para induzir a especificação glial, incubar as esferas de corticoterapia em meio de enriquecimento glial por duas semanas para obter esferas gliais precoces. Para a maturação das esferas iniciais da glia, substitua o fator de crescimento básico de fibroblastos H por 20 nanogramas por mililitro de fator inibidor da leucemia e mantenha as esferas por quatro semanas.

Após quatro semanas em meio de maturação, continuar mantendo as esferas em meio de enriquecimento glial por longos períodos. Para evitar agregação e perda de viabilidade, pique mecanicamente as esferas da glia a cada duas semanas, usando uma lâmina industrial estéril. Substitua todo o meio por DNase um para remover fragmentos de DNA gerados pelo corte. Em seguida, desassocie as esferas da glia em monocamadas de células progenitoras de astrócitos, usando um kit de dissociação de papaína. Colocar as células dissociadas numa cultura de células, placa aderente tratada pré-revestida com Matrigel numa diluição de um a 80. Propagar as células progenitoras dos astrócitos em meio de enriquecimento glial até atingirem 80% de confluência. A passagem das células removem o meio gasto e o coletam em um tubo cônico. Adicione o meio de descolamento de células enzimáticas às células e aguarde um a dois minutos. Assim que as células começarem a se desprender, adicione o meio gasto para neutralizar a atividade enzimática. Recolher a suspensão celular e centrifugar a 800 g durante dois minutos. Depois de descartar o sobrenadante, ressuspenda as células em meio de enriquecimento glial. Coloque aproximadamente uma vez 10 elevado a seis células por poço em um prato revestido com Matrigel em uma diluição de um a 80. Para criopreservação, ressuspenda o pellet celular em uma mistura fria de 90% de meio de proliferação da esfera de corticoterapia e 10% de crioprotetor. Transfira as células ressuspensas para frascos criogênicos. Mova imediatamente os frascos criogênicos para uma caixa criogênica e guarde em um freezer a 80 graus Celsius negativos durante a noite. No dia seguinte, transfira todos os frascos criogênicos para um tanque de nitrogênio líquido para armazenamento de longo prazo. Caracterize as células progenitoras de astrócitos dissociadas por imunocoloração com marcadores Vimenton e fator nuclear IAM. Para confirmar a especificidade regional de quatro cérebros de APCs derivadas de IPSC humanas, realize uma análise de QPCR em tempo real para a caixa de cabeça de garfo humana G1 e a caixa homeo humana, B4. Diferencie APCs em astrócitos e meio de diferenciação astrocítica por 14 dias. Placa de astrócitos em um prato de fundo de vidro de 35 milímetros a uma densidade de cinco vezes 10 elevado à potência de três células por prato para medir sua resposta à adenosina cinco trifosfato. Deixe as células aderirem ao fundo do vidro por 24 horas. Lave as células aderidas três vezes com a solução salina balanceada de Hank sem cálcio. Em seguida, incube as células no meio de cultura contendo cinco diureídeo métrico de razão micromolar 2:00 AM e 0,02% de F127 plurônico por uma hora em temperatura ambiente. Depois de lavar as células duas vezes com meio de cultura, substitua o meio por dois milimolares de cálcio contendo a solução de sal balanceado de Hank. Visualize as células a dois quadros por segundo, usando uma objetiva de imersão em óleo de 60X em um microscópio invertido com compensação de desvio focalizado. Finalmente, registre as respostas de cálcio induzidas por ATP após a adição de ATP a uma concentração final de cinco milimolares na marca de 25 segundos. As colônias de IPSC humanas expressaram marcadores pluripotentes optam por quatro e nano, conforme confirmado pela imunocoloração. As APCs derivadas da síndrome do X frágil e linhas de controle mostraram proporções comparáveis de células positivas para vimentina e NFIA. As células progenitoras de astrócitos de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos da síndrome do X frágil e de controle exibiram regulação positiva de Fox G1, em comparação com HOXB4, indicando uma identidade de prosencéfalo. Os astrócitos derivados de linhagens da síndrome do X frágil do IPSC humano mostraram um número reduzido de expressão de GFAP. Os astrócitos controle e da síndrome do X frágil exibiram transientes de cálcio induzidos por ATP, mas o número de respondedores foi significativamente menor nos astrócitos da síndrome do X frágil. A amplitude de pico do primeiro transiente de cálcio evocado por ATP foi significativamente menor nos astrócitos da síndrome do X frágil em comparação com as células controle. Os astrócitos da síndrome do X frágil derivados de IPSC humanos mostraram um aumento na glicólise, capacidade glicolítica e reservas glicolíticas, mas mostraram uma diminuição significativa na respiração máxima em comparação com os astrócitos de controle.