Name: Edição de Epigenoma CRISPR em Células Humanas usando Transfecção de DNA de Plasmídeo e Entrega de Nucleofecção de mRNA (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-30T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Aprenda a editar o epigenoma em células humanas usando transfecção de DNA de plasmídeo e nucleofecção de mRNA. Este método permite modular genes sem quebras tóxicas no DNA, reduzindo a toxicidade.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Embora o conteúdo genômico de todas as células do nosso corpo seja quase idêntico, o perfil transcricional de cada tipo de célula difere muito. Modificações epigenéticas no DNA e nas proteínas histonas são os principais reguladores da expressão transcricional. A eucromatina transcricionalmente ativa é marcada por marcas epigenéticas distintas em comparação com a heterocromatina compacta e transcricionalmente inativa. Por exemplo, as regiões heterocromáticas são definidas por modificações repressivas de histonas, incluindo trimetilação na lisina 9 da histona 3 (H3K9me3), trimetilação na lisina 27 da histona H3 (H3K27me3) e metilação do DNA em citosinas próximas a guaninas (CpG) nos promotores do gene1. As regiões genômicas da expressão gênica ativa são definidas tipicamente pela acetilação e trimetilação de histonas na lisina 4 da histona 3 (H3K4me3)1.
A revolução das repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas (CRISPR) gerou uma grande variedade de ferramentas que permitem a alteração programada de sequências genômicas. A tecnologia CRISPR é baseada em um mecanismo de defesa procariótico capaz de clivar ácidos nucléicos em sequências-alvo programáveis. As nucleases CRISPR 2,3,4, os editores de base 5,6 e os editores principais 7,8 podem alterar a sequência de DNA dos genomas de mamíferos por meio do corte de DNA e reparo dessas quebras. Embora eficazes, essas estratégias podem causar quebras de DNA em locais fora do alvo 9,10 e mutações estruturais genômicas em larga escala11,12,13,14,15. Ferramentas alternativas baseadas em CRISPR permitem a modulação tratável da ativação e repressão gênica sem alterar a sequência de DNA subjacente. Essas ferramentas aproveitam um Cas9 deficiente em nuclease (dCas9), permitindo a ligação ao DNA em locais-alvo ditados pela sequência de sgRNA, em combinação com proteínas efetoras que alteram a paisagem da cromatina16 , 17 , 18 . Proteínas efetoras, como escritores, leitores e borrachas epigenéticas, podem ser diretamente fundidas a dCas9 ou recrutadas por um andaime peptídico fundido a dCas9, como SunTag, ou um andaime de RNA no sgRNA, como o sistema MS2-MCP16 , 17 , 18 . Exemplos de ferramentas de controle de transcrição programáveis incluem ativação CRISPR (CRISPRa)19,20,21 e interferência CRISPR (CRISPRi)22,23. O CRISPRa funciona recrutando diretamente a maquinaria de transcrição, aumentando a expressão gênica transcricional alvo19. Em contraste, o CRISPRi reprime a transcrição estabelecendo H3K9me3, uma marca epigenética repressiva22.
Os avanços na edição do epigenoma permitiram o amplo uso dessas ferramentas em campos científicos. Fusões de diferentes domínios efetores e proteínas expandiram o kit de ferramentas de editores de epigenoma disponíveis 18,24,25,26,27,28,29,30. Além disso, os editores de epigenoma são usados para decifrar os papéis das modificações epigenéticas 31,32,33,34,35,36, efetores 37,38,39 e mutações efetoras 28,40,41 na regulação gênica. Especificamente, CRISPRi e CRISPRa são usados em telas genômicas funcionais para uma variedade de processos biológicos, incluindo sobrevivência celular42 e destino celular 43,44,45,46,47. Além disso, a edição do epigenoma possui potencial terapêutico para engenharia celular ex vivo e terapias in vivo 18.
Aqui, descrevemos métodos para aplicar dois editores de epigenoma baseados em dCas9 para repressão transcricional programável em linhagens celulares humanas: CRISPRi22 e CRISPRoff48. CRISPRi é uma fusão de dCas9 para o domínio repressivo KRAB de uma proteína de dedo de zinco, como ZNF10 (KOX1) e ZIM322,23. Quando o CRISPRi é direcionado a um promotor de gene específico, o domínio KRAB recruta um escritor H3K9me3, SETDB1, para reprimir o gene alvo (Figura 1A). Quando o CRISPRi é expresso transitoriamente, o H3K9me3 estabelecido no locus alvo não é mantido e a expressão gênica é restaurada ao longo do tempo32,48. Para conduzir knockdowns estáveis usando CRISPRi, como em aplicações de genômica funcional, a expressão constitutiva de CRISPRi nas células junto com o sgRNA é essencial. Recentemente, o CRISPRoff foi projetado para programar a edição hereditária do epigenoma48. CRISPRoff é uma fusão de proteína única de dCas9 para o domínio KRAB e complexo metiltransferase de DNA de novo, DNMT3A e DNMT3L. Um pulso transitório de CRISPRoff em células humanas programa a deposição de H3K9me3 e metilação do DNA nos genes-alvo, o que leva à repressão de longo prazo dos genes-alvo pela manutenção da metilação do DNA e H3K9me3 (Figura 1B) 48 . Além disso, as edições do epigenoma podem ser revertidas. Por exemplo, um gene que é silenciado de forma estável por CRISPRoff pode ser reativado por TET1-dCas9, que pode remover enzimaticamente as marcas de metilação do DNA nos loci alvo49.
Este protocolo detalhará dois métodos de entrega para a expressão transitória de editores de epigenoma: transfecção de DNA de plasmídeo e nucleofecção de mRNA. Além disso, descrevemos como usar a citometria de fluxo para avaliar a eficácia da edição do epigenoma em dois genes endógenos, CLTA e CD55. Esses métodos podem ser adaptados e aplicados a outros experimentos de edição de epigenoma usando editores adicionais ou podem ser usados para direcionar diferentes genes.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68089/68089fig01.jpg"> 
Figura 1: Esquema do mecanismo de edição do epigenoma CRISPRi e CRISPRoff e fluxo de trabalho. (A) Esquemas lineares do transgene sgRNA e editor de epigenoma CRISPRi. A adição de CRISPRi e sgRNA permite a adição da marca de histona repressiva H3K9me3 para silenciar o locus alvo. O nível mais alto de silenciamento é alcançado logo após a adição de CRISPRi, e o alvo do gene geralmente é reativado após algumas passagens. (B) Esquemas lineares do transgene sgRNA e editor de epigenoma CRISPRoff. A adição de CRISPRoff a células direcionadas a um gene de interesse leva à adição de H3K9me3 repressivo junto com a metilação do DNA em locais CpG para silenciar o gene alvo. O silenciamento por CRISPRoff é hereditário - o alto nível de silenciamento é alcançado no início da transfecção e persiste em várias divisões celulares. (C) Visão geral da linha do tempo para edição do epigenoma via método de transfecção. No dia 0, as células são plaqueadas para transfecção. No dia 1, o plasmídeo editor e guia pode ser introduzido nas células por meio de transfecção. No dia 3, as células serão avaliadas quanto à expressão de BFP por citometria de fluxo. A porcentagem de BFP é usada como um fator de normalização para determinar a eficácia final de silenciamento do experimento para cada condição. No dia 6 em diante, as células são analisadas para silenciar o repórter de interesse, pois o nível mais alto de silenciamento será alcançado neste dia. (D) Visão geral do método de transfecção em que o editor de epigenoma e os plasmídeos sgRNA são adicionados às células de maneira gota a gota. (E) Visão geral da linha do tempo para edição do epigenoma por meio dos métodos de nucleofecção. Neste protocolo, o mRNA é nucleofecção nas células no dia 0. As células são avaliadas quanto ao silenciamento no dia 3 pós-nucleofecção usando análise de citometria de fluxo. (F) Visão geral do protocolo de nucleofecção. Quantidades apropriadas de células e mRNA são misturadas e adicionadas em cubetas nucleofectoras. Se o sgRNA for introduzido por nucleofecção, ele também pode ser adicionado a essa mistura. As cubetas são colocadas no nucleofector e os códigos de pulso apropriados são usados para introduzir o mRNA nas células. Após a nucleofecção, as células são plaqueadas e passadas para análise em dias posteriores. (G) Comparação entre transfecção de plasmídeo e estratégias de nucleofecção de mRNA para edição de epigenoma. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68089/68089fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>4D-Nucleofector</td><td>Lonza</td><td>AAF-1003</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de tecidos de 96 poços</td><td>Corning</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>Placa de fundo em U de 96 poços</td><td>Corning</td><td>351177</td><td></td></tr><tr><td>APC anticorpo CD55 anti-humano</td><td>BioLegend</td><td>311312</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSymphony A1 Citômetro de fluxo</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>Waxie</td><td></td><td></td>11003428432</tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5425</td><td></td></tr><tr><td>Contador de Células Automatizado Countess</td><td>Thermo Scientific</td><td>Countess 3</td><td></td></tr><tr><td>CRISPRoff transfecção plasmídeo</td><td>Addgene&nbsp;</td><td></td><td></td>167981</tr><tr><td>Reagente de hematologia diluente 2 para citometria de fluxo (fluido de bainha)</td><td>Thermo Scientific</td><td>23-029-361</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, alta glicose</td><td>Thermo Scientific 11965118</td><td></td><td></td>Tubos</tr><tr><td>Eppendorf</td><td>Gibco</td><td>14-190-250</td><td></td></tr><tr><td>Thomas</td><td>scientific</td><td>1159M35</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Avantor Seradigm</td><td>89510-186</td><td></td></tr><tr><td>Lonza Walkersville&nbsp; SF Cell Line 4D-Nucleofector X Kit L</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0281111</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE&trade; Kit de Transcrição T7 ULTRA</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM1345</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr> tubos <tr><td>de tira PCR</td><td>USA Scientific&nbsp;</td><td>1402-4700</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>plasmídeo de expressão de sgRNA pLG1</td><td>Addgene&nbsp;</td><td></td><td></td>217306</tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>22-400-105</td><td></td></tr><tr><td>SF Linha Celular 96-well Nucleofector&reg; &nbsp; Kit</td><td>Lonza</td><td>V4SC-2096</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de cultura de tecidos</td><td>PHCbi</td><td>MCO-170AICUVDL-PA</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de transfecção TransIT-LTI</td><td>Mirus</td><td>MIR 2306</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%)</td><td>Gibco</td><td>25200114</td><td></td></tr></tbody></table>

edição de epigenoma crispr em células humanas usando transfecção de dna de plasmídeo e entrega de nucleofecção de mrna

CRISPR Epigenome Editing in Human Cells using Plasmid DNA Transfection and mRNA Nucleofection Delivery

Para todos os experimentos de edição de epigenoma, controles adequados são essenciais para avaliar as eficiências de edição de epigenoma. Recomendamos o uso de um sgRNA de controle, que não tem como alvo nenhuma sequência no genoma humano. O uso de um controle de guia sem direcionamento dará confiança de que as alterações nos loci de destino são conduzidas pelo editor de epigenoma sendo direcionado para esse local, e não apenas pela superexpressão do editor de epigenoma ou ligação não específica. Além disso, para experim...

Edição de Epigenoma CRISPR em Células Humanas usando Transfecção de DNA de Plasmídeo e Entrega de Nucleofecção de mRNA

Epigenetics refers to chemical modifications of histone proteins and DNA that can regulate the expression of genes. The human epigenome is altered ...

crispr-epigenome-editing-human-cells-using-plasmid-dna-transfection

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Este vídeo demonstra uma técnica de edição de genoma baseada em nuclease de dedo de zinco em células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs). Como as hPSCs podem ser potencialmente diferenciadas em vários tipos de células, essa tecnologia é útil para estudos patológicos e farmacológicos in vitro de maneira específica do paciente.

Edição do genoma baseada em nuclease de dedo de zinco: uma técnica para modificar o genoma em células-tronco pluripotentes humanas por mecanismo de reparo dependente de homologia de fita dupla

A edição do genoma de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) pode ser feita de forma rápida e eficiente. Apresentado aqui é um procedimento experimental robusto para projetar geneticamente hPSCs, como exemplificado pela edição do locus de porto seguro AAVS1 para expressar EGFP e introduzir resistência a antibióticos.

Estabelecimento de Genoma-editados pluripotentes humanas Lines Stem Cell: A partir de Segmentação de Isolamento

Este protocolo descreve o fluxo de trabalho de um gene CRISPR/Cas9-baseado edição sistema de reparação de mutações pontuais em células de mamíferos. Aqui, usamos uma abordagem combinatória para gene edição com uma estratégia detalhada de follow-on experimental para medir indel formação no local de destino — em essência, analisando o mutagenesis local.

Uma metodologia padrão para examinar a mutagenicidade no local como uma função de ponto de mutação reparação catalisada por CRISPR/Cas9 e SsODN em células humanas

Utilizando um Cas9 preassembled ribonucleoprotein complexo (RNP) é um método poderoso para edição de genoma preciso e eficiente. Aqui, destacamos a sua utilidade em uma ampla variedade de células e organismos, incluindo células humanas primárias e os dois clássicos e emergentes organismos modelo.

Maior genoma edição com Cas9 Ribonucleoprotein em diversas células e organismos

CRISPR-Cas é uma tecnologia poderosa para projetar os genomas complexos de plantas e animais. Aqui, detalhamos um protocolo eficiente editar o genoma humano usando diferentes endonucleases de Cas. Destacamos importantes considerações e parâmetros de projeto para otimizar a eficiência de edição.

Edição do genoma em linhas de células de mamíferos usando CRISPR-Cas

Alvo de DNA Epigenoma edição representa uma poderosa abordagem terapêutica. Este protocolo descreve a produção, purificação e concentração de vetores Lentivirus all-in-one, abrigando o transgene CRISPR-dCas9-DNMT3A para aplicativos de edição de Epigenoma em células-tronco pluripotentes induzidas humana (hiPSC)-derivado de neurônios.

Vetor de Lentivirus de plataforma para a entrega eficiente de ferramentas de edição de Epigenoma em humanos induzida por modelos de doenças derivadas de células-tronco pluripotentes

É apresentado aqui um protocolo para a edição eficiente do gene de CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-negociado em pilhas de mamíferos usando o electroporation do tubo.

CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteína-mediada por Gene preciso de edição por tubo Electroporation

Este protocolo fornece um método para facilitar a geração de mudanças heterozygous ou homozygous definidas do nucleotide usando CRISPR-CAS9 em pilhas de haste pluripotentes humanas.

Geração de modificações genómicas definidas usando CRISPR-CAS9 em células-tronco pluripotentes humanas

Aqui, descrevemos um método detalhado para edição de genes sem costura em células-tronco pluripotentes humanas usando um plasmídeo doador baseado em piggyBac e o mutante Cas9 nickase. Duas mutações pontuais foram introduzidas no éxon 8 do locus do fator nuclear 4 alfa do hepatócito (HNF4α) em células-tronco embrionárias humanas (hESCs).

Introduzindo mutações pontuais em células-tronco pluripotentes humanas usando edição de genoma contínua

A entrega de editores genômicos como RNAs é um meio particularmente potente de modificar os genomas das células primárias e linhagens celulares de mamíferos. O objetivo desse protocolo é entregar editores genômicos como mRNA em células e linhagens celulares primárias de mamíferos, seguido por sequenciamento e análise direcionados da Illumina para quantificar os resultados da edição.

Edição do Genoma em Células Primárias de Mamíferos por Eletroporação do RNA Editor

Aprenda a editar o epigenoma em células humanas usando transfecção de DNA de plasmídeo e nucleofecção de mRNA. Este método permite modular genes sem quebras tóxicas no DNA, reduzindo a toxicidade.

Edição de Epigenoma CRISPR em Células Humanas usando Transfecção de DNA de Plasmídeo e Entrega de Nucleofecção de mRNA

Explorar mais vídeos