Edição de Epigenoma CRISPR em Células Humanas usando Transfecção de DNA de Plasmídeo e Entrega de Nucleofecção de mRNA
30 de maio de 2025
O protocolo descreve métodos para edição de epigenoma baseada em Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) em linhagens de células humanas usando transfecção de DNA de plasmídeo e nucleofecção de mRNA.
Esta pesquisa tem como objetivo projetar e fornecer editores epigenômicos em células humanas. Fazemos isso fundindo efetores de cromatina com dCas9 para modulação gênica direcionada sem introduzir quebras tóxicas de DNA. Os desafios giram em torno da entrega eficiente de editores de epigenoma nas células e da garantia da especificidade precisa do alvo.
Além disso, alcançar a repressão gênica estável ou transitória continua difícil. Este protocolo evita quaisquer mecanismos de clivagem, reduzindo a toxicidade e a instabilidade genômica. Ele descreve dois métodos de entrega para modulação controlada da expressão gênica sem alterações permanentes na sequência de DNA.
Esses métodos podem ser aplicados para testar diferentes fusões com dCas9 e para estudar a biologia básica da cromatina. Os editores de epigenoma atuais podem ser usados para telas de todo o genoma e têm potencial para aplicações terapêuticas. Para começar, mantenha as células K-562 em um frasco com meio RPMI suplementado com 10% de FBS e penicilina estreptomicina glutamina.
No dia da nucleofecção, descongele o mRNA CRISPRoff em um tubo de microcentrífuga estéril sem RNAse e subtraia suavemente o tubo. Use dois microgramas de mRNA por 2,0 vezes 10 elevado a cinco células em cada poço de um tubo de tira de PCR colocado no gelo. Preparar a solução de nucleofecção de acordo com as instruções do fabricante e deixá-la aquecer até à temperatura ambiente durante 15 minutos antes da nucleofecção.
Colha e conte células K-562 usando um contador de células automatizado com coloração viva/morta de azul tripano. Para nucleofecção em uma cubeta de tira, alíquota aproximadamente duas vezes 10 elevado à potência de cinco células por amostra em um tubo de microcentrífuga estéril. Centrifugar as células a 500 G durante cinco minutos à temperatura ambiente.
Descarte o sobrenadante. Adicionar PBS à temperatura ambiente ao sedimento da célula e centrifugar novamente a 500 G durante cinco minutos. Descarte o sobrenadante.
Ressuspenda as células na quantidade apropriada de solução de nucleofectora. Adicione o volume calculado de solução celular a dois microgramas de solução CRISPRoff. Transfira a célula e a solução de mRNA para uma cubeta, garantindo que não se formem bolhas, pois isso pode comprometer a eficiência da nucleofecção.
Bata suavemente na nucleocuvette para assentar as células na parte inferior. Em seguida, nucleofecte as células usando o sistema 4D-Nucleofector com o código de pulso apropriado. O código de pulso pode precisar ser otimizado para diferentes tipos de células.
Consulte o fabricante se for necessária uma otimização adicional. Após a nucleofecção, adicione 80 microlitros de meio RPMI a cada poço usado da nucleocuvette. Transfira a suspensão celular para um poço de uma placa de 24 poços contendo 400 microlitros de meio RPMI pré-aquecido.
Carregue todos os arquivos padrão de citometria de fluxo, ou FSC, no FlowJo arrastando e soltando-os em uma nova planilha. Clique em todas as amostras para começar a fazer portões. Abra uma amostra de controle clicando duas vezes no arquivo correspondente.
Crie uma porta para células ativas em um gráfico FSC-A versus SSC-A usando a ferramenta de polígono. Uma guia de células ativas agora deve aparecer abaixo do nome da amostra na lista de todas as amostras. Clique com o botão direito do mouse neste portão e selecione copiar análise para agrupar para aplicar este portão a todas as amostras.
Clique duas vezes no portão de células vivas para selecionar apenas células vivas. Altere os eixos para FSC-H versus FSC-A. Desenhe um polígono para portar apenas células únicas.
Para bloquear as células que expressam guia, clique duas vezes no portão de célula única para selecionar apenas células individuais. Altere os eixos para FSC-A versus PE-CF594-A. Desenhe uma porta para células de expressão de guia usando a ferramenta de polígono.
Clique duas vezes no último portão de configuração, células individuais ou células de expressão guia. Se estiver realizando uma transfecção de plasmídeo em que o editor de epigenoma codifica uma proteína fluorescente azul, ou fusão BFP, crie uma porta para células positivas para BFP para amostras do segundo dia. Crie uma porta para a expressão do repórter plotando BB515-A em relação ao FSC-A para identificar e bloquear células GFP negativas.
Em seguida, aplique esta porta a todas as amostras. Depois de concluir a configuração do gating, clique no editor de tabelas no painel superior. Arraste populações para análise, como células BFP positivas e GFP negativas.
No painel do editor de tabelas, clique em criar tabela e copie os dados antes de colá-los em uma planilha para cálculos de normalização. Agora, subtraia o número de células repórter negativas, como GFP negativa, na amostra de controle de todas as outras amostras. Isso corrige o silenciamento de fundo do repórter.
Se estiver realizando uma transfecção, divida cada valor pela porcentagem de células positivas para BFP medidas no segundo dia para normalizar todos os valores para a porcentagem de células positivas para BFP e, em seguida, multiplique por 100. Isso produz o valor normalizado da eficiência de transfecção das células editadas. Plote os dados para criar gráficos de linha que representem as mudanças no curso de tempo de edição do epigenoma.
Para todos os experimentos de edição de epigenoma, recomenda-se um controle de guia sem direcionamento para confirmar que as alterações nos loci alvo resultam da edição do epigenoma, em vez de superexpressão ou ligação inespecífica do editor de epigenoma. É importante considerar o método de entrega do editor de epigenoma. A transfecção de DNA de plasmídeo ou nucleofecção de mRNA pode ser preferida devido ao contexto experimental.
A consideração do tipo de célula, cronograma experimental, leitura de entrega e eficácia de entrega pode afetar o método de entrega preferido. Células que expressam altos níveis de BFP dois dias após a transfecção indicam transfecção bem-sucedida com o editor de epigenoma. Tanto o CRISPRoff quanto o CRISPRi mostram o pico de silenciamento do gene no quinto dia após a transfecção.
Em experimentos de nucleofecção de mRNA, um forte silenciamento gênico é observado no terceiro dia pós-nucleofecção com CRISPRoff.
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Visão Geral
Este protocolo descreve métodos para entregar editores epigenômicos em células humanas utilizando técnicas baseadas em CRISPR. Ao fundir efetores da cromatina ao dCas9, pode-se obter modulação gênica direcionada sem introduzir quebras tóxicas no DNA.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Genética
- Biologia Celular
Antecedentes
- A entrega eficiente de editores do epigenoma nas células é um desafio significativo.
- Manter a especificidade precisa do alvo é crucial para a modulação gênica bem-sucedida.
- A repressão gênica estável ou transitória pode ser difícil de alcançar.
- Este protocolo evita mecanismos de clivagem para reduzir a toxicidade e a instabilidade genômica.
Objetivo do Estudo
- Projetar e entregar editores epigenômicos em células humanas.
- Permitir a modulação gênica direcionada sem quebras tóxicas do DNA.
- Fornecer métodos para modulação controlada da expressão gênica.
Métodos Utilizados
- Transfeção de DNA plasmidial
- Nucleofecção de mRNA
- Fusão de efetores da cromatina com dCas9
- Evitação de mecanismos de clivagem
Resultados Principais
- Entrega bem-sucedida de editores do epigenoma em células humanas.
- Modulação gênica direcionada alcançada sem introduzir quebras no DNA.
- Redução da toxicidade e da instabilidade genômica observada.
- Os métodos permitem modulação controlada da expressão gênica.
Conclusões
- Este protocolo fornece métodos eficazes para edição do epigenoma.
- Aborda desafios fundamentais nas técnicas de modulação gênica.
- Aplicações futuras podem aprimorar abordagens de terapia gênica.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A edição do epigenoma baseada em CRISPR permite a regulação gênica programável e específica de locus em células humanas sem introduzir quebras no DNA, reduzindo a instabilidade genômica e a toxicidade. Essa abordagem apoia a descoberta inicial e a validação de alvos ao permitir a modulação precisa e reversível da expressão gênica, facilitando a desmistificação mecanicista e a investigação funcional de vias relevantes para doenças. A compatibilidade do protocolo com a transfeção de DNA plasmidial e a nucleofecção de mRNA amplia sua utilidade em diversos sistemas celulares e cronogramas experimentais.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação funcional de mecanismos regulatórios gênicos sem alteração permanente do genoma.
- Apóia a desmistificação mecanicista ao distinguir efeitos epigenéticos diretos de toxicidade fora do alvo.
- Facilita a repressão ou ativação gênica rápida e reversível para esclarecimento de vias.
- Oferece uma plataforma para testar múltiplas fusões dCas9-efetoras em sistemas relevantes para doenças.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prepara modelos celulares validados para triagem de compostos posteriores mediante a modulação da expressão gênica por mecanismos epigenéticos.
- Permite a avaliação quantitativa da eficiência de edição utilizando citometria de fluxo e normalização por repórter.
- Oferece suporte a fluxos de trabalho reprodutíveis e escalonáveis para triagem em alto rendimento de editores do epigenoma.
- Permite normalização e correção de fundo para garantir resultados confiáveis nos ensaios.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Permite modelar o silenciamento gênico estável ou transitório relevante para a progressão da doença e intervenção terapêutica.
- Alinha-se a estratégias translacionais de biomarcadores ao permitir repressão gênica duradoura (CRISPRoff) ou modulação transitória (CRISPRi).
- Apóia a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica, evitando alterações genômicas permanentes.
- Reduz o risco de instabilidade genômica confundidora em modelos pré-clínicos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo integra-se à continuidade entre descoberta e pré-clínico ao permitir modulação gênica orientada por hipóteses, desenvolvimento de ensaios e modelagem translacional sem edição permanente do genoma.
- Biologia da Descoberta: Apoia testes de hipótese nula e análise de vias por meio da regulação gênica direcionada e reversível.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas e reprodutíveis para padronização de ensaios e avaliação de compostos.
- Análises: Oferece medições normalizadas e corrigidas quanto ao fundo para comparar condições de edição e métodos de entrega.
- Pesquisa Translacional: Permite modelar a regulação epigenética relevante para doenças e resposta terapêutica.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma modular e adaptável para diversos alvos genéticos e tipos celulares em programas de P&D.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos e reduz a ambiguidade mecanicística.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização, reprodutibilidade e escalabilidade dos fluxos de trabalho de modulação gênica.
- Valor Estratégico: Melhora a tomada de decisões de avançar/não avançar e a eficiência do capital ao minimizar riscos biológicos em estágios avançados.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização e o avanço ajustados ao risco de alvos gênicos com base em evidências funcionais.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em design de CRISPR, cultivo celular e análise de citometria de fluxo.
- Necessita de acesso a equipamentos de nucleofecção e software analítico para leituras quantitativas.
- Exige padronização entre equipes das estratégias de seleção de eventos e procedimentos de normalização.
- Deve ser adaptado conforme o tipo celular, método de entrega e cronograma experimental, de acordo com as necessidades do projeto.
- A consideração da eficácia de entrega e dos controles do repórter é fundamental para uma interpretação confiável.
