Isolamento e cultura de células Müller primárias da retina de ratos Sprague-Dawley (SD)

Este protocolo descreve o isolamento e a cultura de células de Muller retinianas primárias de ratos Sprague-Dawley SD, que podem auxiliar na pesquisa da retina na comunidade científica. O protocolo abrange dissecção de retina, extração e identificação de IC e principais considerações de controle. Este protocolo estabelece um método eficaz, eficiente, padronizado e dispendioso para extrair e recuperar RMCs de seus racks SD legais. O modelo RMC pode ser usado para simular condições patológicas como diabética, normalidade e para auxiliar os efeitos de drogas.

[Narrador] Para começar, despeje a solução de D-Hank em dois pratos de cultura de vidro de 10 centímetros. Depois de sacrificar e desinfetar o rato SD neonatal, posicione-o em um prato curvo estéril. Usando uma pinça de dente, rasgue a pele da pálpebra ao longo da fissura palpebral para expor o globo ocular do rato. Segure a pinça desdentada aberta e paralela à fissura palpebral para pressionar o orbital. Assim que o nervo óptico for alcançado e o globo ocular estiver exposto, feche a pinça para levantar e extrair o globo ocular. Agora coloque o globo ocular em um prato de cultura de vidro com a solução de D-Hank. Enxágue o globo ocular e transfira-o para outro prato com a solução fresca de D-Hank. Em seguida, usando uma micropinça oftálmica curva, fixe suavemente a região entre a córnea e o nervo óptico para expor a córnea. Perfure a junção escleral da córnea usando uma microtesoura da córnea e corte ao longo do limbo de forma circular. Faça duas incisões esclerais simétricas de aproximadamente dois milímetros de comprimento antes de soltar a pinça e pinçar novamente na junção do nervo óptico e da esclera. Em seguida, use uma segunda pinça para pressionar suavemente perto da raiz do nervo óptico, direcionando a pressão para a interface do nervo óptico da córnea. Quando o tecido do cristalino aparecer, remova-o com cuidado e continue pressionando até que o tecido da retina apareça. Usando uma pinça, transfira o tecido retiniano separado para outra placa de cultura estéril. Abra a tampa da placa de cultura e use uma pipeta com uma ponta de um mililitro para pipetar o tecido da retina para cima e para baixo cerca de 15 vezes para quebrá-lo em pequenos pedaços. Em seguida, incube o tecido com um mililitro de tripsina a 0,25% a 37 graus Celsius por cinco minutos. Retire a placa de cultura da incubadora e coloque-a na bancada limpa. Adicione dois mililitros de meio completo e pipete suavemente para interromper a digestão. Agora filtre a suspensão celular através de uma tela de náilon de malha 300 em uma centrífuga de 15 mililitros duas. Lave o prato de cultura com PBS preparado e colete a suspensão restante. Em seguida, gire o tubo a 878 G por cinco minutos em temperatura ambiente. Após centrifugação, aspirar e rejeitar o sobrenadante. Ressuspender o sedimento em dois mililitros de meio completo e centrifugar novamente a 878 G durante cinco minutos para purificar as células. Depois de descartar o sobrenadante, ressuspender as células em dois mililitros de meio completo. Pegue um frasco T25 com três mililitros de meio completo e adicione um mililitro da suspensão celular. Agitar o balão em cruz antes de o colocar na incubadora. Após 48 horas de incubação, retirar o balão da incubadora e colocá-lo no banco limpo. Descarte o meio gasto e lave a superfície aderente da célula três vezes com um mililitro de PBS, que contém 1% de penicilina mais estreptomicina. Em seguida, adicione cinco mililitros de meio fresco e completo e continue a incubação até que a confluência celular exceda 90%. Lave as células três vezes com um mililitro de PBS contendo 1% de penicilina estreptomicina. Em seguida, incube as células com um mililitro de solução de tripsina EDTA a 0,25% por um minuto e 30 segundos. Agora, observe o frasco sob um microscópio invertido. Quando as células parecerem redondas, destacadas e começarem a flutuar, adicione dois mililitros de meio de cultura completo ao frasco para interromper a digestão. Em seguida, use uma pipeta para aspirar a suspensão celular e transferir toda a suspensão celular para um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Enxágue a parede do frasco com dois mililitros de PBS contendo 1% de penicilina estreptomicina e adicione-o ao mesmo tubo. Centrifugar o tubo a 878 g durante cinco minutos à temperatura ambiente. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular num volume adequado de meio completo. Finalmente, passe as células na proporção de um para dois ou de um para três, conforme necessário. As células de Muller da retina de segunda passagem ou RMCs exibiram morfologias em forma de estrela ou fusiforme com núcleos redondos ou ovais e citoplasma abundante. A coloração de hematoxilina e eosina revelou células fusiformes e em forma de estrela com citoplasma rosa abundante e núcleos ovais localizados centralmente interconectados por estruturas filamentosas finas. A coloração por imunofluorescência de RMCs revelou forte fluorescência vermelha em células marcadas para glutamina sintetase e aquaporina-4 e fluorescência verde brilhante para CRALBP, Kir4.1 e Vimentina. NeuN, o controle negativo não foi detectado na análise de imunofluorescência, confirmando a especificidade do isolamento do RMC. A análise por citometria de fluxo mostrou que 98,7% das células foram positivas para Glutamina Sintetase e 97% foram positivas para CRALBP, indicando uma alta pureza dos RMCs.