Extração de DNA baseada em matriz para sequenciamento de próxima geração direcionado em amostras de escarro descontaminadas

Nossa pesquisa é sobre a redução do tempo de resposta do diagnóstico de TB e subsequente início, incorporando NGS para atendimento personalizado ao paciente. Nosso protocolo otimiza o TNGS para uso rotineiro, abordando a integração do fluxo de trabalho, o custo e o tempo de resposta, com o objetivo de reduzir os atrasos no diagnóstico e melhorar o início oportuno do tratamento.

Este protocolo permite uma extração de DNA econômica, rápida e de qualidade suficiente de amostras clínicas em poucas horas em comparação com os métodos convencionais de CTAB, que levam até três dias.

Nossos resultados levantam questões-chave sobre a integração do TNGS em diagnósticos de rotina e a otimização dos métodos de extração para amostras de esfregaço negativo e escassas para melhorar a sensibilidade e a utilidade clínica. Exploraremos se as amostras remanescentes de diagnósticos de rotina podem ser usadas para sequenciamento a jusante, incluindo o sequenciamento direto do genoma completo do escarro para agilizar e expandir a vigilância genômica da TB.

[Narrador] Para começar, obtenha um sedimento de escarro inativado pelo calor. Centrifugue a amostra a 16.800 G, ou velocidade máxima por 15 minutos. Com uma pipeta de 20 a 200 microlitros, aspire e descarte suavemente o sobrenadante, garantindo que o pellet permaneça intacto. Agite suavemente a suspensão da matriz para misturar e, em seguida, pipete 200 microlitros da matriz bem misturada para ressuspender o pellet. Transfira o volume total para um tubo com tampa de rosca de 1,5 mililitro contendo três contas de vidro pré-esterilizadas de dois milímetros de diâmetro. Agora, coloque as amostras em um bloco de aquecimento a 56 graus Celsius por 15 minutos. Após a incubação, homogeneizar as amostras com um vórtice por 10 segundos para dispersar as células e, em seguida, incubar as amostras em um bloco de aquecimento a 100 graus Celsius por 10 minutos. Homogeneizar as amostras usando um homogeneizador de alta velocidade com um ciclo de 60 segundos a 4,0 metros por segundo. Em seguida, centrifugue a suspensão a 12.000 G por cinco minutos. Transfira 130 microlitros do sobrenadante contendo DNA para um tubo novo de baixa ligação de 1,5 mililitro sem perturbar o pellet. Descarte o primeiro tubo contendo a matriz e os detritos celulares. Para purificar o DNA usando esferas magnéticas, primeiro vortex a garrafa de estoque de contas magnéticas ou alíquota preparada completamente para ressuspender as contas antes de usar, em seguida, adicione 1,2 vezes o volume de contas magnéticas ao DNA extraído, pipete a suspensão 10 vezes para misturar as amostras antes de incubar em temperatura ambiente por cinco minutos. Coloque as amostras em um rack magnético de tubo de 1,5 mililitro por três minutos ou até que o líquido fique claro, depois aspire e descarte cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar as contas. Com os tubos no ímã, adicione 200 microlitros de etanol a 80%, garantindo que as esferas permaneçam intactas. Após uma incubação de 30 segundos, aspire cuidadosamente e descarte o etanol sem perturbar as contas. Após a segunda lavagem, remova qualquer etanol residual usando uma pipeta de um a 10 microlitros. Deixe os tubos abertos para secar ao ar por 10 minutos ou até que tenham uma aparência fosca. Assim que as contas tiverem uma aparência fosca, remova os tubos do ímã e adicione 50 microlitros de água livre de nuclease diretamente nas esferas em cada amostra. Em seguida, misture cada amostra individual pipetando 10 vezes. Inspecione o tubo em busca de contas presas dentro. Após uma incubação de cinco minutos em temperatura ambiente, coloque os tubos de volta no rack magnético por três minutos ou até que o líquido esteja límpido. Com os tubos no rack magnético, transfira o sobrenadante contendo DNA para um tubo estéril de baixa ligação claramente marcado. A concentração de DNA foi maior em amostras de sedimentos de dois mililitros, em comparação com 500 microlitros em todos os graus de esfregaço. Maior variabilidade no rendimento de DNA foi observada em amostras de sedimento de 500 microlitros. A profundidade de cobertura das leituras de sequenciamento foi maior em amostras de sedimentos de dois mililitros em comparação com 500 microlitros em todos os graus de esfregaço. A variabilidade foi maior em três amostras de grau de esfregaço extraídas de sedimentos de 500 microlitros. Os escores de aceitabilidade do sequenciamento foram geralmente mais altos em amostras de dois mililitros em comparação com 500 microlitros, com uma proporção maior de resultados altamente aceitáveis. As amostras de esfregaço grau três mais tiveram a maior proporção de resultados aceitáveis, em comparação com os graus de esfregaço um mais e dois mais. As amostras de 500 microlitros tiveram mais casos classificados como inaceitáveis ou não determinados.