Estabelecimento e Análise Histológica de Organoides Esofágicos Modelando a Progressão de Tecidos Normais para Cancerosos

Nossa pesquisa se concentra na iniciação do tumor e na tumorigênese inicial. Examinamos como as células normais se transformam em células tumorais e como essas células modificam seu microambiente para facilitar a tumorigênese. Atualmente, existem muitas tecnologias usadas para promover a pesquisa, incluindo tecnologias de células-tronco, tecnologias de edição de genes, sistema avançado de cultura 3D e biomateriais e tecnologias ômicas espaciais e de célula única. O maior desafio que enfrentamos é manter os organoides livres de bactérias e fungos. Esses contaminantes se infiltram durante o manuseio e transporte de tecidos, muitas vezes arruinando nossas culturas.

[Instrutor] Para começar, descongele a matriz da membrana basal e o meio de cultura organoide esofágico humano a quatro graus Celsius. Transfira a amostra de tecido para tubos de centrífuga de cinco mililitros e, em seguida, lave a amostra três vezes com tampão de lavagem em temperatura ambiente. Usando uma tesoura estéril, pique o tecido em fragmentos de um milímetro cúbico em tubos de centrífuga de 1,5 mililitro. Agora, suspenda os fragmentos de tecido em um mililitro de tampão de digestão. Agite a mistura a 37 graus Celsius a 50 a 100 rotações por minuto por 10 a 20 minutos para digerir o tecido. Em seguida, centrifugue a mistura a 400G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, descarte o sobrenadante. Ressuspenda o pellet em 500 microlitros de 0,025% de tripsina-EDTA. Incube a suspensão a 37 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, adicione um mililitro de DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino para interromper a atividade enzimática. Em seguida, passe a suspensão por um filtro estéril de 70 micrômetros e colete o filtrado em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro. Centrifugue o filtrado por cinco minutos a 400G a quatro graus Celsius. Ressuspenda as células em 100 microlitros de H-EOCM após descartar o sobrenadante. Depois de ressuspender as células, determine a densidade celular usando um contador de células. Em seguida, transfira 5.000 a 15.000 células por mililitro para um novo tubo de 1,5 mililitro. Para a semeadura de organoides, ressuspenda suavemente as células em 50 a 100 microlitros de matriz da membrana basal. Pipete 50 microlitros da mistura de células da matriz para o centro de cada poço de uma placa de 24 poços. Incube a 37 graus Celsius por 30 minutos para polimerizar a matriz da membrana basal. Agora pipete 500 microlitros de H-EOCM pré-aquecido para cada poço para cobrir a matriz. Em seguida, incube a placa em uma incubadora umidificada com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius. Para substituir o meio, aspirar o meio gasto. Reabasteça cada poço com 500 microlitros de H-EOCM fresco pré-aquecido a 37 graus Celsius. Realizar coloração por imunofluorescência multiplex em organoides reparaffinizados e reidratados. Adicione a solução de bloqueio de soro de ovelha para cobrir os organoides em uma lâmina colocada em uma câmara de umidade e incube a lâmina em temperatura ambiente por 30 minutos. Lave a lâmina com interpolação contendo PBS por dois minutos. Em seguida, solte o anticorpo primário diluído para cobrir a área organoide. Incubar em uma câmara de umidade de acordo com os requisitos de anticorpos. Após a incubação, lavar as lâminas em PBS-T duas vezes por dois minutos a 80 PMM em câmara termoestável. Agora coloque a solução de anticorpo secundário na área organoide e incube em uma câmara de umidade em temperatura ambiente por 20 minutos. Após a incubação, lavar as lâminas em PBS-T duas vezes por dois minutos a 80 RPM em uma câmara termoestável. Pipetar a solução de corante fluorescente sobre a lâmina lavada para cobrir a área organoide e incubar novamente. Após a incubação, lave as lâminas em PBS-T duas vezes. Para multicoloração, repita a recuperação do antígeno e o bloqueio de anticorpos. Em seguida, solte a solução delicada para cobrir a área organoide. Mergulhe as lâminas em água esterilizada por dois minutos para remover o excesso de mancha. Adicione um suporte de montagem antidesvanecimento e aplique lamínula antes de adquirir imagens digitais. As estruturas organoides tornaram-se cada vez mais desorganizadas dos estágios normal para o carcinoma, conforme visualizado pela coloração KRT6A. A expressão de PDL1 aumentou progressivamente da mucosa esofágica normal para o carcinoma espinocelular do esôfago.