En face Crioseccionamento de retina de camundongo para análise molecular espacial de alta dimensão

A retina é um modelo útil para entender os cálculos neuronais. Esses cálculos dependem das posições especiais das células. No entanto, mapas abrangentes disso permaneceram indescritíveis.

Na última década, o sequenciamento de células únicas forneceu descrições claras dos tipos de células da retina. Agora, a transcriptômica espacial fornece uma nova maneira de usar essas descrições em tecido intacto. Um desafio crítico para o uso da transcriptômica espacial é que eles exigem seções de tecido muito finas. A retina já é bastante fina no plano horizontal em que estamos interessados.

Ao inventar esse método para criar seções finas e rápidas, usar transcriptômica espacial em aprendizado de máquina para mapear todas as células ganglionares da retina no mesmo tecido. Nos últimos 30 anos, apenas 17 das 45 células ganglionares da retina de camundongos foram mapeadas, e essa técnica nos permitiu mapear todas elas de uma só vez.

[Instrutor] Para começar, coloque um mouse sacrificado na mesa de trabalho. Correu o pólo temporal do globo na córnea para manter a orientação e criar um ponto fraco para dissecação. Mergulhe o globo e aponte a solução em um prato contendo um pedaço de papel de filtro. Com uma pinça afiada número cinco e uma tesoura de íris, remova cuidadosamente toda a musculatura, fáscia, vasculatura e nervos do globo sem perfurar a esclera. Posicione a ponta de uma lâmina de tesoura Iris perpendicular à marca da córnea. Perfure o globo nesta posição. Faça uma única incisão limpa através da córnea e do limbo, continuando na esclera e na retina em direção à cabeça do nervo óptico. Em seguida, posicione a lâmina perpendicularmente ao corte inicial, aproximadamente um milímetro posterior ao limbo. Comece a cortar radialmente através da esclera e da retina. Mantenha uma linha de corte consistente posterior e paralela ao limbo usando pinças afiadas para guiar e girar o globo. Se a retina e a esclera se separarem, reposicione a lâmina da tesoura Iris para cortá-las juntas. Estime a distância posterior de um milímetro usando a largura média da lâmina da tesoura Iris Depois de concluir o corte radial paralelo ao limbo, inspecione as conexões retinianas restantes. Corte-os cuidadosamente com uma tesoura de íris até que as seções anterior e posterior do globo estejam separadas. Em seguida, use dois pares de pinças afiadas número cinco para separar suavemente as porções anterior e posterior do globo. Em camundongos mais velhos, se fibras transparentes conectarem o cristalino ao copo retiniano, corte-as cuidadosamente com uma tesoura de íris, minimizando a separação escleral da retina. Usando o papel de filtro como plataforma de suporte, corte a retina em uma folha de trevo, também chamada de padrão de cruz de ferro com tesoura de íris. Repita a dissecção com o segundo olho. Corte a ponta de uma pipeta de transferência de plástico descartável para criar uma abertura maior do que a retina e a esclera dissecadas. Sugue suavemente a retina na pipeta e deposite-a em uma lâmina de microscópio de vidro. Com um lenço de laboratório, remova o excesso de solução de mira até que a retina não flutue mais e possa ser achatada. Agora use duas pinças afiadas número cinco para desdobrar a retina e posicione-a plana com o copo interno do olho voltado para cima. Faça cortes de alívio de 0,5 a dois milímetros de comprimento em cada segmento de alívio do trevo para ajudar no achatamento e ajuste para evitar dobras. Remova qualquer solução de mira restante, exceto o líquido adjacente à retina. Usando uma lamínula, pressione e transfira rapidamente a retina para que a esclera externa fique voltada para cima e a ocular interna fique em contato com a lamínula. Verifique se a retina não está dobrada e faça ajustes, se necessário. Adicione a solução de mira para auxiliar na manipulação, mas remova o excesso com um pano para evitar o enrolamento e deixe secar ao ar por cinco a 10 segundos. Agora aplique o meio OCT para cobrir a retina. Em seguida, use uma pinça para espalhar uniformemente a camada pela lamínula para evitar flutuação. Congele rapidamente a retina em meio OCT usando uma placa de metal resfriada com vapor de nitrogênio líquido ou entrando em contato direto com gelo seco. Armazene a retina congelada em gelo seco para uso imediato. Para criosecção, crie uma cúpula OCT no mandril da amostra, ocupando os dois a três anéis internos se estiver usando o mesmo modelo de criostato. Alinhe o mandril da amostra com a superfície de corte. Crie ou anote o guia de orientação relacionando o mandril ao criostato stage. Em seguida, apare a cúpula para formar uma superfície plana paralela à lâmina. Com uma lâmina de barbear, remova o excesso de OCT lateralmente e separe cuidadosamente a retina da lamínula para torná-la móvel. Remova o mandril do stage e aplique uma pequena gota de OCT líquido na superfície plana preparada. Em seguida, coloque a retina diretamente sobre a OCT líquida. Use uma lâmina de vidro pré-resfriada para pressionar e segurar a retina até congelar. Aplique mais OCT sobre a retina e chuck para garantir a colagem. Em seguida, congele o conjunto na área de congelamento rápido do criostato. Para seccionar, corte cuidadosamente o excesso de OCT até que a retina esteja visível. Use uma lâmina de barbear para moldar as bordas do bloco OCT perto da retina. Continue aparando enquanto inspeciona a presença de esclera. Quando a esclera estiver visível, ajuste o ângulo do palco conforme necessário. Pare de aparar quando a esclera estiver aproximadamente uniformemente distribuída entre as seções. Agora, use slides pré-resfriados e dois pincéis para manipular as seções e coletá-las. Coloque um dedo sob a seção por cerca de cinco segundos até que a OCT derreta e adira o tecido à lâmina. Em seguida, retorne a lâmina para uma superfície fria para congelar novamente. Armazene as lâminas preparadas em gelo seco para uso imediato. A imunorreatividade distinta ou RBPMS na camada de células ganglionares e a separação clara dos plexos vasculares marcados com lectina de tomate confirmaram a preservação bem-sucedida da laminação retiniana e dos marcadores proteicos. A detecção de RNA multiplex usando um painel de escopo de RNA de 12 plex manteve com sucesso a estrutura espacial e revelou a expressão distinta de marcadores como Grm6 e RBPMS em toda a fatia da face. Imagens de alta resolução confirmaram padrões de expressão de célula única para RBPMS e outros marcadores como Mafb6 e Meis2, validando a localização de proteínas e RNAs na camada de células ganglionares. A distribuição uniforme do sinal nas seções de folhas do trevo e os sinais fortes nos dados transcriptômicos espaciais de xênio confirmaram o perfil de alto rendimento e a integridade do RNA bem-sucedidos. A visualização de resolução de célula única usando xênio correspondeu aos padrões de detecção manual, confirmando a robustez do protocolo em todas as plataformas. Os marcadores de transcrição específicos do tipo de célula mostraram distribuição laminar estratificada na seção transversal da retina e no mapeamento facial, preservando sua localização em profundidades. O zoom detalhado na camada de células ganglionares confirmou a detecção precisa de transcritos espaciais em relação à coloração nuclear DAPI.