Name: Espátula Montevidéu Dispositivo para vitrificação de embriões de mamíferos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-06T15:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Aprenda a vitrificar embriões de mamíferos com o protocolo Espátula Montevidéu usando ferramentas caseiras e soluções crioprotetoras. Este método eficiente preserva embriões de camundongos e ovelhas com altas taxas de sobrevivência após descongelamento.

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Os animais utilizados para a obtenção de embriões de camundongos foram alojados e manuseados de acordo com a legislação nacional 18.611 e as diretrizes internacionais de cuidados com os animais11. O protocolo experimental (licença número #007-18) foi oportunamente aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Institut Pasteur de Montevideo (consentimento por escrito). Os protocolos experimentais para ovócitos/embriões de ovinos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados com os Animais Fundación IRAUy (protocolo #001-2017), atendendo às diretrizes ARRIVE12 e foram realizados de acordo com as diretrizes internacionais de cuidados com animais11.
1. Vitrificação (Figura 2)
<ol>
	<li>Preparação de espátula MVD<ol>
		<li>Encurte a ponta do carregador de gel (consulte a Tabela de Materiais) cortando os primeiros 10 mm e o cone da ponta. NOTA: Isso cria uma ponta mais curta e reta, facilitando a vedação final com o canudo de 0,5 mL (consulte a Tabela de Materiais).</li>
		<li>Segure a extremidade da ponta do carregador de gel com a pinça #5 do relojoeiro (consulte a Tabela de Materiais) a aproximadamente 1.0 cm da ponta. Coloque suavemente a ponta na chama de um bico de Bunsen (consulte a Tabela de Materiais) e segure por 8 a 10 s para formar uma plataforma semelhante a uma pétala de aproximadamente 1 mm2.</li>
		<li>Retire da chama e segure firmemente com a pinça por 5 s.</li>
		<li>Usando um estereomicroscópio (consulte a Tabela de Materiais), verifique se a plataforma em forma de pétala (~ 1 mm2) está formada e a borda distal está selada. NOTA: A plataforma deve ser fechada na extremidade distal para evitar a infiltração de LN2 durante a vitrificação. Certifique-se de que a plataforma esteja limpa e livre de roscas plásticas. Se for muito pequeno ou tiver roscas, apare a ponta e repita o procedimento.</li>
		<li>Repita as etapas 1.1.1-1.1.4 para preparar o número necessário de espátulas (1 espátula = até 40 embriões de camundongo).</li>
		<li>Esterilize as espátulas usando raios ultravioleta (UV) ou óxido de etileno e guarde-as em um tubo ou caixa estéril.</li>
		<li>No dia da vitrificação, recupere as espátulas, manuseando-as na extremidade oposta da plataforma. Insira uma haste de identificação (consulte a Tabela de Materiais) em cada espátula e coloque-as na base do estereomicroscópio. Rotule a haste com um marcador permanente ou etiqueta adesiva resistente ao nitrogênio líquido. NOTA: Evite sempre tocar na plataforma ao manusear as espátulas. O comprimento total do dispositivo completo (espátula + canudo de 0,5 mL + haste de identificação) não deve exceder mais de 1 cm do comprimento da taça.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparação de soluções de vitrificação<ol>
		<li>Prepare a solução FS: Dissolva 1,5 g de meio de gradiente de densidade (ver Tabela de Materiais) e 0,85 g de sacarose (ver Tabela de Materiais) em 5 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS; ver Tabela de Materiais). Aqueça em banho-maria fervente até dissolver completamente e, em seguida, esterilize com um filtro de 0,22 μm (consulte a Tabela de Materiais). NOTA: Esta solução pode ser conservada a 4 °C até 6 meses.</li>
		<li>Prepare a solução de pré-vitrificação (PV): No dia da vitrificação, misture 10% de etilenoglicol (ver Tabela de Materiais), 10% de dimetilsulfóxido (ver Tabela de Materiais) e 80% de meio M2 (ver Tabela de Materiais). É necessário um volume total de 100 μL para 5 espátulas.</li>
		<li>Prepare a solução de vitrificação (V): No dia da vitrificação, combine 15% de etilenoglicol, 15% de dimetilsulfóxido, 10% de meio M2 e 60% de solução FS. Um volume total de 100 μL é necessário para 5 espátulas.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Processo de desidratação e vitrificação de embriões<ol>
		<li>Prepare o LN2: Despeje o LN2 em um recipiente adequado (por exemplo, um recipiente de poliestireno isolado de 10 cm x 30 cm x 20 cm) e coloque tantos canudos de 0,5 mL quanto espátulas a serem usadas. NOTA: Para facilitar a visualização da plataforma da espátula durante a manipulação sob LN2, sugere-se que um recipiente de poliestireno isolado com fundo colorido seja usado para criar um efeito de contraste. CUIDADO: Use óculos e luvas apropriados (consulte a Tabela de Materiais) ao manusear o LN2.</li>
		<li>Prepare as soluções: Em uma placa de Petri de plástico de 100 mm (consulte a Tabela de Materiais), coloque as seguintes gotas: 100 μL de M2, 20 μL de solução PV e 20 μL de solução V para cada espátula.</li>
		<li>Vitrificar embriões: Coloque os embriões a serem vitrificados na gota M2. Manuseie 30-40 embriões de cada vez, incubando-os na gota de solução PV por 30 s e, em seguida, na gota de solução V por mais 30 s em temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Use um capilar de vidro puxado (consulte a Tabela de Materiais) com um conjunto de tubo aspirador (consulte a Tabela de Materiais). Pré-carregue o capilar com pelo menos 1 μL da respectiva solução antes de colocar os embriões. NOTA: Os embriões estarão em alturas diferentes nas gotas, portanto, ajuste o micrômetro do estereomicroscópio para localizá-los. Recupere embriões de cada gota quando restarem 10 s. Todas as manipulações de embriões devem ser realizadas sob o estereomicroscópio.</li>
		<li>Carregar embriões: Aspire os embriões usando uma solução V mínima (por exemplo, ~ 0,1 μL) e coloque-os rapidamente na plataforma da espátula.</li>
		<li>Imersão em LN2: Após carregar os embriões, mergulhe imediatamente a plataforma da espátula em LN2 por 5 s (segurando a espátula com a mão, pela haste). Em seguida, mantendo a espátula em vapores de LN2 , sele-a com um canudo de 0,5 mL usando uma pinça longa de aço inoxidável (consulte a Tabela de Materiais). NOTA: Remova o LN2 do canudo antes de selar para evitar a expansão durante o aquecimento. Certifique-se de que a espátula e o canudo estejam alinhados corretamente para evitar o contato entre a gota do embrião e a parede do canudo. Por conveniência, as espátulas seladas podem permanecer no recipiente LN2 até que todas as espátulas estejam carregadas com embriões, reabastecendo com LN2 conforme necessário.</li>
		<li>Repita o procedimento: Repita as etapas 1.3.3 a 1.3.7 para cada grupo de embriões, usando um novo par de gotas de PV e V.</li>
		<li>Armazenamento: Transfira as espátulas para taças (consulte Tabela de materiais) e, em seguida, para um dewar de armazenamento LN2 (consulte Tabela de materiais).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68176/68176fig02.jpg"> 
Figura 2: Esquema do processo de vitrificação usando Espátula MVD. Veja o texto para mais detalhes. Criado em BioRender. Meikle, M. (2025) https://BioRender.com/x96y902. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68176/68176fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
2. Aquecimento (Figura 3)
<ol>
	<li>Preparação da solução<ol>
		<li>Prepare uma solução de sacarose 1 M dissolvendo 0,85 g de sacarose em 2,5 mL de meio M2. Esterilizar a solução com um filtro de 0,22 μm. NOTA: Esta solução pode ser preparada e conservada a 4 °C durante um período máximo de 1 semana.</li>
		<li>Preparar soluções de sacarose 0,5 M e 0,25 M diluindo a solução de sacarose 1 M com o volume adequado de meio M2.</li>
		<li>Manter as soluções de sacarose a 37 °C numa placa quente (ver Tabelas de Materiais) até ao início do aquecimento.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparação da placa de aquecimento<ol>
		<li>Em uma placa de Petri de plástico de 100 mm, coloque as seguintes gotas de solução: uma gota de 500 μL de sacarose 0,5 M, uma gota de 50 μL de sacarose 0,5 M e uma gota de 50 μL de sacarose 0,25 M para cada espátula a ser aquecida. Coloque três gotas de meio M2 (100 μL cada) para lavar.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Processo de aquecimento NOTA: O processo de aquecimento ocorre em RT, por exemplo, 20-22 °C na base de um estereomicroscópio.<ol>
		<li>Recupere as espátulas seladas do dewar. Coloque-os em um recipiente apropriado com LN2. Veja a Figura 3.</li>
		<li>Coloque a placa de aquecimento no estereomicroscópio. Um de cada vez, segure a base da espátula com uma pinça de aço inoxidável e, com a mão enluvada, puxe a haste de identificação e depois o canudo. Mergulhe rapidamente a plataforma contendo os embriões na gota de sacarose 0,5 M de 500 μL.</li>
		<li>Certifique-se de que todos os embriões caíram na gota; Se necessário, mova suavemente a espátula para ajudar na sua libertação. Carregue os embriões em um capilar de vidro puxado, coloque-os na gota de 50 μL de solução de sacarose 0,5 M e incube por 2 min.</li>
		<li>Coloque os embriões na gota de 50 μL de solução de sacarose 0,25 M e incube por mais 2 min. NOTA: Antes de colocar os embriões em cada solução, pré-carregue o capilar com a solução a ser usada.</li>
		<li>Por fim, lave os embriões três vezes em diferentes gotas de meio M2 para remover a sacarose.</li>
		<li>Incubar os embriões em condições adequadas para cada espécie durante pelo menos 1 h antes da utilização.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68176/68176fig03.jpg"> 
Figura 3: Esquema do processo de aquecimento da Espátula MVD. Veja o texto para mais detalhes. Criado em BioRender. Meikle, M. (2025) https://BioRender.com/k91k191. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68176/68176fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<ol><li>Crispo, M., Meikle, M. N., Rülicke, T. Cryopreservation of Valuable Mouse and Rat Lines. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCrispo%2C+M+%22Rodent+Quality+Control%3A+Genes+and+Bugs.+Laboratory+Animal+Science+and+Medicine%22">Rodent Quality Control: Genes and Bugs. Laboratory Animal Science and Medicine</a>. , Springer. Cham. (2024).</li>
<li>Lloyd, K., Franklin, C., Lutz, C., Magnuson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducibility%3A+use+mouse+biobanks+or+lose+them%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reproducibility: use mouse biobanks or lose them.</a> Nature. 522 (7555), 151-153 (2015).</li>
<li>Hart-Johnson, S., Mankelow, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Archiving+genetically+altered+animals%3A+a+review+of+cryopreservation+and+recovery+methods+for+genome-edited+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Archiving genetically altered animals: a review of cryopreservation and recovery methods for genome-edited animals.</a> Lab Anim. 56 (1), 26-34 (2022).</li>
<li>Shaw, J. M., Jones, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terminology+associated+with+vitrification+and+other+cryopreservation+procedures+for+oocytes+and+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod+Update%22%5BJournal%5D)">Terminology associated with vitrification and other cryopreservation procedures for oocytes and embryos.</a> Hum Reprod Update. 9 (6), 583-605 (2003).</li>
<li>Arav, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+oocytes+and+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of oocytes and embryos.</a> Theriogenology. 81 (1), 96-102 (2014).</li>
<li>dos Santos Neto, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryotolerance+of+Day+2+or+Day+6+in+vitro+produced+ovine+embryos+after+vitrification+by+Cryotop+or+Spatula+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Cryotolerance of Day 2 or Day 6 in vitro produced ovine embryos after vitrification by Cryotop or Spatula methods.</a> Cryobiology. 70 (1), 17-22 (2015).</li>
<li>Renard, J. P., Babinet, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+survival+of+mouse+embryos+after+rapid+freezing+and+thawing+inside+plastic+straws+with+1-2+propanediol+as+cryoprotectant%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool%22%5BJournal%5D)">High survival of mouse embryos after rapid freezing and thawing inside plastic straws with 1-2 propanediol as cryoprotectant.</a> J Exp Zool. 230 (3), 443-448 (1984).</li>
<li>Tsang, W. H., Chow, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+embryo+cryopreservation+utilizing+a+novel+high-capacity+vitrification+spatula%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Mouse embryo cryopreservation utilizing a novel high-capacity vitrification spatula.</a> Biotechniques. 46 (7), 550-552 (2009).</li>
<li>Kuwayama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+vitrification+for+cryopreservation+of+human+oocytes+and+embryos%3A+the+Cryotop+method%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: the Cryotop method.</a> Theriogenology. 67 (1), 73-80 (2007).</li>
<li>Nakao, K., Nakagata, N., Katsuki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+efficient+vitrification+procedure+for+cryopreservation+of+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Anim%22%5BJournal%5D)">Simple and efficient vitrification procedure for cryopreservation of mouse embryos.</a> Exp Anim. 46 (3), 231-234 (1997).</li>
<li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals%22">Guide for the Care and Use of Laboratory Animals</a>. , National Academies Press. Washington, DC. (1996).</li>
<li>du Sert, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ARRIVE+guidelines+2.0%3A+Updated+guidelines+for+reporting+animal+research%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The ARRIVE guidelines 2.0: Updated guidelines for reporting animal research.</a> PLoS Biol. 18 (7), e3000410(2020).</li>
<li>Meikle, M. N., Schlapp, G., Menchaca, A., Crispo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimum+volume+Spatula+MVD+vitrification+method+improves+embryo+survival+compared+to+traditional+slow+freezing%2C+both+for+in+vivo+and+in+vitro+produced+mice+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Minimum volume Spatula MVD vitrification method improves embryo survival compared to traditional slow freezing, both for in vivo and in vitro produced mice embryos.</a> Cryobiology. 84, 77-81 (2018).</li>
<li>Momozawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+vitrification+of+mouse+embryos+using+the+Kitasato+Vitrification+System+as+a+novel+vitrification+device%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Efficient vitrification of mouse embryos using the Kitasato Vitrification System as a novel vitrification device.</a> Reprod Biol Endocrinol. 15 (1), 29(2017).</li>
<li>Stringfellow, D. A., Givens, M. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStringfellow%2C+DA+%22Manual+of+the+International+Embryo+Transfer+Society%3A+A+Procedural+Guide+and+General+Information+for+the+use+of+Embryo+Transfer+Technology+Emphasizing+Sanitary+Procedures%22">Manual of the International Embryo Transfer Society: A Procedural Guide and General Information for the use of Embryo Transfer Technology Emphasizing Sanitary Procedures</a>. , International Embryo Transfer Society. (2010).</li>
<li>Dos Santos-Neto, P. C., Cuadro, F., Barrera, N., Crispo, M., Menchaca, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+survival+and+birth+rate+after+minimum+volume+vitrification+or+slow+freezing+of+in+vivo+and+in+vitro+produced+ovine+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Embryo survival and birth rate after minimum volume vitrification or slow freezing of in vivo and in vitro produced ovine embryos.</a> Cryobiology. 78, 8-14 (2017).</li>
<li>Schlapp, G., Meikle, M. N., Pórfido, J. L., Menchaca, A., Crispo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zygote+cryobanking+applied+to+CRISPR%2FCas9+microinjection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Zygote cryobanking applied to CRISPR/Cas9 microinjection in mice.</a> PLoS One. 19 (7), e0306617(2024).</li>
<li>Kamoshita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+of+oocyte%2Fembryo+vitrification+in+mammals+from+rodents+and+large+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Sci+J%22%5BJournal%5D)">Recent advances of oocyte/embryo vitrification in mammals from rodents and large animals.</a> Anim Sci J. 95 (1), e13931(2024).</li>
<li>Qiu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equilibrium+vitrification+of+mouse+embryos+using+low+concentrations+of+cryoprotectants%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Equilibrium vitrification of mouse embryos using low concentrations of cryoprotectants.</a> Cryobiology. 98, 127-133 (2021).</li>
<li>Tsang, W. H., Chow, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+mammalian+embryos%3A+Advancement+of+putting+life+on+hold%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res+C+Embryo+Today%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of mammalian embryos: Advancement of putting life on hold.</a> Birth Defects Res C Embryo Today. 90 (3), 163-175 (2010).</li>
</ol>

A eficiência da geração de animais geneticamente modificados (GM) aumentou significativamente devido ao desenvolvimento de métodos baseados em endonuclease, particularmente CRISPR/Cas9. Muitos laboratórios em todo o mundo produzem várias linhagens de camundongos e ratos GM que devem ser criopreservadas para evitar deriva genética e manter a integridade dofenótipo 1 original. Além disso, o arquivamento elimina a necessidade de reprodução constante, o que geralmente resulta em número excessivo de animais. Alguns laboratórios enviam linhagens de camundongos GM como embriões ou espermatozoides criopreservados para repositórios internacionais, facilitando a troca desses modelos e evitando o transporte de animais vivos. Isso garante acessibilidade às linhas sem a geração repetitiva de modelos animais GM idênticos2. Por essas razões, a criopreservação de embriões e espermatozoides é fundamental em qualquer instalação animal GM. Geralmente, a criopreservação de embriões é preferida para armazenar linhagens GM porque os embriões contêm o genoma diplóide completo com modificações e podem ser facilmente recuperados por meio da transferência de embriões.
A vitrificação é um processo de não equilíbrio caracterizado por um desequilíbrio entre a água que entra na célula e a água que forma cristais extracelulares ao seu redor. Este método evita a formação de cristais de gelo intracelulares, distinguindo-o do método de congelamento lento (SLF)3 (ver Figura 1). A alta concentração de crioprotetores e o contato direto com nitrogênio líquido (LN2) permitem um resfriamento ultrarrápido (~40 °C/s), alcançando um estado vítreo das amostras em segundos. Além disso, a vitrificação é mais rápida, fácil e menos dispendiosa do que o congelamento lento4. Requer LN2 mínimo e normalmente emprega equipamentos simples que podem ser comprados comercialmente ou caseiros5 (ver Figura 1).
Além disso, o processo de aquecimento é geralmente rápido e replicável. Deve ser realizada rapidamente para evitar toxicidade crioprotetora e manter o estado vítreo3. Ao congelar embriões, muitos laboratórios consideram a conveniência do dispositivo transportador, sua confiabilidade, robustez, capacidade de retenção e custos.
Preferimos o método de vitrificação de espátula de volume mínimo para criopreservação de rotina de embriões de ovelhas e camundongos, usando o dispositivo Spatula Montevideo (MVD)6. Inicialmente, empregamos o método de congelamento lento7 , mas rapidamente fizemos a transição para a vitrificação. Para criar um dispositivo mais simples e eficiente em termos de espaço para o dewar LN2 , modificamos a espátula caseira de Tsang e Chow (2009)8, que é conectada a um criotubo, para desenvolver a espátula MVD que é selada com um canudo de 0,5 mL (ver Tabela de Materiais). A espátula possui uma ponta de carregador de gel (ver Tabela de Materiais), onde uma plataforma de aproximadamente 1 mm² é formada pela fusão suave da ponta com pinças finas, criando uma placa semelhante a uma pétala para carregar os embriões. Esta plataforma pode acomodar até 40 embriões de camundongos em uma pequena gota de vitrificação. Uma haste de identificação (consulte a Tabela de Materiais) é inserida na extremidade aberta da ponta do carregador de gel.
O objetivo deste método é vitrificar embriões de forma simples, rápida e barata que, além disso, economize espaço no dewar de nitrogênio. Este sistema tem sido usado com sucesso por muitos anos, proporcionando excelentes taxas de sobrevivência de embriões (~ 97%) e resultados reprodutivos, particularmente em embriões de camundongos. Como a Espátula MVD é preparada em laboratório, é um método de baixo custo em comparação com os dispositivos comerciais9. Além disso, economiza espaço no dewar de nitrogênio em comparação com o uso de criotubos 8,10.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68176/68176fig01.jpg"> 
Figura 1: Comparação das duas principais técnicas utilizadas para criopreservação de embriões. Essa figura foi modificada com permissão de Crispo et al.1. Criado em BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68176/68176fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>0,22 &micro; Filtro M&nbsp;</td><td>Sartorius</td><td>16534</td><td>Filtro de seringa Minisart 0.2 &micro; L</td></tr><tr><td>0,5 mL de palha</td><td>Minitubo</td><td>13408/0044</td><td>Paillette médio tipo francês</td></tr><tr><td>Conjunto de tubo de aspiração&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Rolamento A5177</td><td></td></tr><tr><td>Bico de Bunsen&nbsp;</td><td>Indulab</td><td>7000134</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Etilenoglicol&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>102466</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll PM70&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F2878</td><td>Gradiente de densidade médio</td></tr><tr><td>Ponta do Gel-carregador</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>10411193</td><td></td></tr><tr><td>Capilar de vidro&nbsp;</td><td>Marienfeld</td><td>2900000</td><td>Tubo capilar de microhematócrito</td></tr><tr><td>Luvas para manuseio de LN2&nbsp;</td><td>Escudo Temp</td><td>CE0338</td><td>Crioglove</td></tr><tr><td>Taças</td><td>Minitubo</td><td>16913/1133</td><td></td></tr><tr><td>Óculos para manuseio de LN2&nbsp; &nbsp;</td><td>3M</td><td>&nbsp; 40661-00000-10</td><td>Revestimento antiembaçante e anti-riscos</td></tr><tr><td>Placa quente</td><td>Labec</td><td>LA-SH-II-5B</td><td>Modelo digital</td></tr><tr><td>Vareta de identificação&nbsp;</td><td>Tecnologias IMV</td><td>6326</td><td>LG48 mm não estéril</td></tr><tr><td>Recipiente de isopor isolado</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dewar do armazenamento de LN2</td><td>Taylor-Wharton</td><td>XT21-AI</td><td>Criociência</td></tr><tr><td>Pinças longas de aço inoxidável</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>11000-25</td><td></td></tr><tr><td>M2&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M7167</td><td></td></tr><tr><td>PBS&nbsp;</td><td>Feito em casa</td><td></td><td>Solução salina tamponada com fosfato. Normalmente, 1 L de tampão concentrado 5x é preparado e depois diluído para 1x. Receita: 40 g de cloreto de sódio, 1 g de cloreto de potássio, 7,2 g de fosfato dissódico anidro, 1,2 g de fosfato monopotássico. Adicione água destilada e esterilize em autoclave.</td></tr><tr><td>Placa de Petri de plástico&nbsp;</td><td>Falcão</td><td>&nbsp; &nbsp; 351029</td><td>Placa de Petri bacteriológica não tratada com TC</td></tr><tr><td>Estereomicroscópio</td><td>Olimpo</td><td>SZ2-LGB</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma</td><td>S1888</td><td></td></tr><tr><td>Relojoeiro' s #5 fórceps&nbsp;</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>11254-20</td><td></td></tr></tbody></table>

espátula montevidéu dispositivo para vitrificação de embriões de mamíferos

Spatula Montevideo Device for the Vitrification of Mammalian Embryos

Espátula Montevidéu Dispositivo para vitrificação de embriões de mamíferos

This study describes an efficient and cost-effective vitrification method for mouse and sheep embryo cryopreservation known as the Spatula Montevideo ...

Para gerar modelos de camundongos geneticamente modificados e, em seguida, criopreservar as linhas como backup. Para isso, precisamos de um método fácil, de baixo custo, eficiente e reprodutível para vitrificar os embriões. A microinjeção ou eletroporação de CRISPR-Cas9 pode ser feita em zigotos vitrificados, de camundongos e gado de aquecimento, resultando em um cronograma mais flexível e reduzindo os animais em uso.A vitrificação de embriões usa resfriamento ultrarrápido para evitar a formação de cristais de gelo, preservando a integridade celular. Essa técnica avança a pesquisa em criobiologia, permitindo estudos sobre viabilidade embrionária, estabilidade genética e resultados de armazenamento a longo prazo. Tanto a espátula MVD quanto as soluções são caseiras. A espátula é selada com um canudo de 0,5 mililitro, ocupando um espaço mínimo no nitrogênio líquido Dewar.[Instrutor] Para começar, corte os primeiros 10 milímetros e o cone da ponta de uma ponta de carregador de gel. Usando a pinça número cinco do relojoeiro, segure a ponta do carregador de gel a aproximadamente um centímetro da ponta e coloque-a suavemente na chama do bico de Bunsen por 8 a 10 segundos para formar uma

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

O filhote corioalantóicas membrana (CAM) é único, um ambiente de cultura naturalmente imunodeficientes apoio para estudar a angiogênese e tumorigênese. Este artigo vídeo demonstra as diferentes etapas no...

Pintinho Ex ovo Cultura e Ex ovo CAM Ensaio: como ele realmente funciona

Este vídeo descreve a injeção pronuclear de vetores lentivirais no espaço perivitelino de um embrião de camundongo fertilizado. O lentivírus contém o transgene, que é incorporado ao genoma do embrião fertilizado, dando origem a camundongos transgênicos.

Injeção de perivitelina baseada em vetor lentiviral: um método para transduzir o gene de interesse em oócitos de camundongo unicelular fertilizados

Transferência de embrião tubário utero-usa a junção útero-tubária como uma barreira para impedir a saída de embriões que podem ocorrer quando se realiza a transferência uterina. Machos vasectomizados são obrigados a obter destinatários pseudográvidas para transferência de embriões. Ambas as técnicas são discutidas.

Transferência de Embrião Utero-tubária e vasectomia no Rato Modelo

Neural mitose de células progenitoras é um parâmetro crítico da neurogénese. Muito do nosso entendimento da mitose progenitor neural é baseado na análise de tecido fixo. Imagens ao vivo em fatias de cérebro de embriões é uma técnica versátil para avaliar a mitose com resolução temporal e espacial de alta em um ambiente controlado.

Imagens ao vivo da mitose no desenvolvimento Cortex embrionárias de camundongos

MicroSecure Vitrification foi desenvolvido como um sistema de dispositivo de vitrificação fechado asséptico não comercial que está em conformidade com as boas práticas de fabricação e manuseio de tecidos da FDA. Devido à retirada de canudos de embriões com tamponamento hidrofóbico da indústria, o procedimento de vitrificação foi modificado para incluir uma vedação interna antes do tampão de algodão interno padrão.

Modificada Vitrificação MicroSecure: Um Altamente procedimento seguro, simples e eficaz para Criopreservação blastócitos humanos

As técnicas reprodutivas assistidas (ARTs) estão em avaliação contínua para melhorar os resultados e reduzir os riscos associados. Este manuscrito descreve um procedimento de transferência de embriões minimamente invasivo com um protocolo de criopreservação eficiente que permite o uso de coelhos como um modelo animal ideal de reprodução humana.

Transferência de embriões minimamente invasivos e vitrificação embrionária na fase de embrião ideal em modelo de coelho

Aqui nós apresentamos um protocolo morfométricos lapso de tempo para acompanhar a intensidade do encolhimento de blastocisto e re-expansão durante as intervenções de previtrification e recuperação pós-aquecimento. A aplicação do protocolo, é possível em vitro laboratórios fertilização equipados com microscópios de lapso de tempo e recomenda-se no desenvolvimento de um método de vitrificação de blastocistos ideal.

Morfométricos protocolo para a avaliação objetiva do comportamento de blastocisto durante a vitrificação e aquecimento passos

A biópsia e a vitrificação do Blastocyst são exigidas para conduzir eficientemente o teste genético do pré-implante. Uma aproximação que implica a abertura seqüencial da zona pelúcida e a recuperação de 7-8 pilhas do trofectoderma no dia 5-7 pós-inseminação limita o número de manipulações exigidas e a exposição do embrião às condições ambientais suboptimal.

Biópsia e vitrificação humana do Blastocyst

Aqui, descrevemos um método para aquecer blastocistos humanos vitrificados, culminando-os através do período de implantação in vitro, digerindo-os em células únicas e coletando células trophoblastas precoces para uma investigação mais aprofundada.

Coleção celular única de células trophoblastos em embriões humanos de estágio de peri-implantação

Aqui, apresentamos um método otimizado para remover prontamente uma parte dos complexos cumulus-oócitos após a recuperação do óvulo para agilizar o processo de observação da fertilização in vitro, reduzindo o tempo necessário para a remoção das células da granulosa, minimizando a exposição do oócito a elementos externos e não impede o desenvolvimento do embrião, melhorando a eficiência dos procedimentos laboratoriais de fertilização in vitro.

A remoção parcial imediata de complexos cumulus-oócitos: uma abordagem refinada para observação rápida da fertilização in vitro

Aprenda a vitrificar embriões de mamíferos com o protocolo Espátula Montevidéu usando ferramentas caseiras e soluções crioprotetoras. Este método eficiente preserva embriões de camundongos e ovelhas com altas taxas de sobrevivência após descongelamento.

Espátula Montevidéu Dispositivo para vitrificação de embriões de mamíferos

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