Entrega e expressão gênica aprimoradas usando injeção intraóssea de nanopartículas de quitosana encapsuladas em plasmídeos editores de base de adenina

Propomos um método de terapia gênica que fornece diretamente a quitosana do editor à base de adenina à medula óssea por meio de injeção intraóssea. A eficiência de transfecção de plasmídeos exógenos em animais experimentais é relativamente baixa e a introdução de plasmídeos para expressão gênica de longo prazo pode ser afetada pelo sistema imunológico. Usamos a quitosana para encapsular plasmídeos editores à base de adenina e entregamos diretamente o complexo à medula óssea de camundongos por meio de injeção intraóssea, tornando-o adequado para doenças causadas por função anormal dos osteoclastos.

Nosso protocolo oferece alta eficiência de transfecção, pequenos danos biológicos e alta eficiência de expressão gênica. Nossa nova estratégia não é apenas adequada para doenças causadas por função anormal dos osteoclastos, mas também tem um potencial significativo para o avanço do campo da terapia genética. Para começar, coloque um rato sacrificado em uma mesa de trabalho.

Usando tesouras cirúrgicas e pinças, remova a tíbia e retire todo o tecido muscular circundante. Mergulhe a tíbia limpa em PBS e lave até que apenas o osso permaneça. Retire um mililitro de PBS em uma seringa e lave as células da medula óssea de uma extremidade da tíbia até que o osso fique completamente branco.

Em seguida, colete a suspensão celular em um tubo. Centrifugue a 800 G a quatro graus Celsius por cinco minutos. Depois de pipetar o sobrenadante, adicione 500 microlitros de tampão de lise de glóbulos vermelhos ao pellet.

Após um minuto, adicione um mililitro de tampão de separação para encerrar a lise. Centrifugar novamente a suspensão a 800 G a quatro graus Celsius durante cinco minutos. Remova o sobrenadante e coloque o pellet celular resultante no gelo para uso posterior.

Para a transfecção de quitosana, dissolva quatro miligramas de quitosana em 20 mililitros de solução de ácido acético. Ajuste o pH para 5,5 usando hidróxido de sódio 10 molar. Em seguida, dispense 500 microlitros da solução de quitosana em tubos de microcentrífuga individuais.

Agora adicione dois, três, quatro e cinco microgramas de plasmídeos ABE em tubos individuais. Dissolva os plasmídeos em 500 microlitros de sulfato de sódio 30 milimolar. Em seguida, misture 500 microlitros de solução de plasmídeo com 500 microlitros de solução de quitosana nos tubos correspondentes.

Incube os tubos em banho-maria a 50 a 55 graus Celsius por 15 minutos. Vortex cada tubo por 15 a 30 segundos e deixe-os repousar sem serem perturbados por 30 minutos. Para caracterização, analise o diâmetro e o potencial zeta da quitosana usando espalhamento dinâmico de luz.

Mantenha a concentração de quitosana em 0,1 miligramas por mililitro em água bidestilada Em seguida, lance 0,1 miligramas por mililitro de amostras de quitosana em um chip de silício. Adicione 20 microlitros das amostras ressuspensas em 200 grades de malha e incuba.

Centrifugar a suspensão de células da medula óssea a 800 G a quatro graus Celsius durante cinco minutos. Descarte o sobrenadante e adicione 500 microlitros de lisado de glóbulos vermelhos. Após um minuto, adicione um mililitro de tampão de separação para interromper a reação.

Em seguida, conte o número de células com um contador de células. Em seguida, transfira 1 milhão de células para um novo tubo de microcentrífuga. Depois de centrifugar novamente, pipetar o sobrenadante e ressuspender as células em 500 microlitros de PBS.

Transfira as células ressuspensas para um tubo de citometria de fluxo e meça a eficiência da transfecção usando citometria de fluxo. Para injeção na cavidade da medula óssea, fixe o camundongo anestesiado em decúbito dorsal na mesa de operação. Use fita adesiva para prender o membro dianteiro no lugar.

Desinfete a tíbia posterior usando um cotonete embebido em álcool. Em seguida, coloque a solução de plasmídeo numa seringa de um mililitro equipada com uma agulha de calibre 26. Remova quaisquer bolhas de ar e mantenha a seringa pronta para injeção.

Em seguida, toque e estabilize a canela do mouse com os dedos. Posicione a agulha de injeção para entrar na diáfise tibial a partir do platô tibial próximo à articulação do joelho. Agora gire a agulha paralelamente à tíbia, insira na cavidade da medula óssea e injete lentamente ao longo de três segundos.

Após a injeção, retire lentamente a agulha ao longo de três segundos. Desinfete imediatamente o local da punção usando um cotonete embebido em álcool para estancar qualquer sangramento. Coloque o mouse em um ambiente quente a 37 graus Celsius para facilitar sua recuperação.

As nanopartículas formadas com os plasmídeos ABE e GRNA tinham uma morfologia esférica uniforme e uma distribuição de tamanho estreita com um tamanho médio de 202,9 nanômetros. Um potencial zeta de 2,77 milivolts e um índice de polidispersidade de 0,22. O plasmídeo ABE embebido em quitosana aumentou significativamente o sinal fluorescente nas células da medula óssea, indicando maior eficiência de transfecção em comparação com o grupo controle.

A citometria de fluxo confirmou que o plasmídeo ABE codificado por quitosana alcançou alta eficiência de transfecção em células da medula óssea. Com o pico de eficiência de 51,2% observado na dose de quatro microgramas, enquanto três microgramas forneceram um equilíbrio de alta eficiência de 47,2% O sequenciamento de Sanger e a PCR do DNA genômico de células da medula óssea revelaram edição gênica in vivo no local alvo A1 com 14,27% de eficiência e no local A2 com 10,69% de eficiência.