Name: In vivo Aplicação da rotulagem de proximidade baseada em TurboID em Drosophila melanogaster (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-13T13:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Aprenda a rotulagem de proximidade com TurboID para mapear interações proteicas em células germinativas de Drosophila melanogaster. Este método identifica interatores conhecidos e novos, revelando mecanismos moleculares essenciais.

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<ol><li>Kim, D. I., Roux, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filling+the+void%3A+Proximity-based+labeling+of+proteins+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trend+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Filling the void: Proximity-based labeling of proteins in living cells.</a> Trend Cell Biol. 26 (11), 804-817 (2016).</li>
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<li>Bosch, J. A., Chen, C. L., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity-dependent+labeling+methods+for+proteomic+profiling+in+living+cells%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22WIREs+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Proximity-dependent labeling methods for proteomic profiling in living cells: An update.</a> WIREs Dev Biol. 10 (1), e392(2021).</li>
<li>Rayaprolu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+biotin+labeling+in+vivo+resolves+regional+neuronal+and+astrocyte+proteomic+differences+in+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific biotin labeling in vivo resolves regional neuronal and astrocyte proteomic differences in mouse brain.</a> Nat Commun. 13, 2927(2022).</li>
<li>Uckun, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+profiling+of+the+alk+proximitome+in+the+developing+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo profiling of the alk proximitome in the developing Drosophila brain.</a> J Mol Biol. 433 (23), 167282(2021).</li>
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<li>Artan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactome+analysis+of+Caenorhabditis+elegans+synapses+by+turboid-based+proximity+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Interactome analysis of Caenorhabditis elegans synapses by turboid-based proximity labeling.</a> J Biol Chem. 297 (3), 101094(2021).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td><forte>Anticorpos</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cabra anticorpo secundário IgG (H+L) de cabra, HRP</td><td>Invitrogen</td><td>31430</td><td>Grau analítico,</td></tr><tr><td>anticorpo secundário anti-coelho de cabra sensível à luz (H+L) altamente adsorvido de forma cruzada, alexa fluor plus 488</td><td>Invitrogen</td><td>A32731</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secundário anti-coelho de cabra (H+L) de grau analítico, sensível à luz, HRP</td><td>Invitrogen</td><td>31460</td><td>Grau analítico,</td></tr><tr><td>anticorpo HSP90 sensível à luz (coelho)</td><td>Tecnologia de sinalização celular</td><td>4874</td><td>Anticorpo policlonal</td></tr><tr><td>Pierce Proteína estreptavidina, HRP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21126</td><td>Grau analítico</td></tr><tr><td>Estreptavidina, Alexa Fluor 594 conjugado</td><td>Invitrogen</td><td>S11227</td><td>Sensível à luz, grau analítico</td></tr><tr><td>Anticorpo V5-tag (camundongo)</td><td>Invitrogen</td><td>R960-25</td><td>Anticorpo monoclonal</td></tr><tr><td>V5-tag (coelho) (D3H8Q)</td><td>Tecnologia de sinalização celular</td><td>13202</td><td>Anticorpo monoclonal</td></tr><tr><td>Fly Lines</td><td>Company<</td><td>strong>Número de catálogo</td><td>Comentários/Descrição</td></tr><tr><td>pUASp Tom20 V5-TurboID/ TM3</td><td>Korea Drosophila Stock Center</td><td>2373-2</td><td>Estoque</td></tr> de <tr><td>moscas pUASp Abobrinha V5-TurboID/Cyo</td><td>Korea Drosophila Stock Center</td><td>2188</td><td>Estoque de moscas</td></tr><tr><td>pUASP_attB_V5-TurboID-NES/Cyo</td><td>Korea Drosophila Stock Center</td><td>2635-4</td><td>Estoque de moscas</td></tr><tr><td>w[*]; P{w[+mC]=matalpha4-GAL-VP16}V2H</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>7062</td><td>Estoque de</td></tr> <tr><td>moscasEquipamentos e consumíveis</td><td>Company</td><td>Número de catálogo<</td><td>strong>Comentários/Descrição</td></tr><tr><td>Balança Analítica</td><td>Mettler Toledo</td><td>ME204</td><td>0,1 mg de resolução</td></tr><tr><td>Membranas de Western Blotting de Nitrocelulose Amersham Protran 0.45 NC (300 mm & vezes; 4 m)</td><td>Cytiva</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>10600002-Axygen 1.7 mL MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube</td><td>Corning</td><td>MCT-175-C</td><td>Co-polímero</td></tr><tr><td>MARCA&nbsp; Vidro de Cobertura (22 mm x 22 mm)</td>Pontas de Pipeta a Granel <td>de</td><td>Vidro Borosilicato</td>BR470055 <td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>(10 &micro; L)</td> <td>Vertex</td><td>4110N00</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de Pipeta a Granel de Propileno (1000 &micro; L)</td> <td>Pontas</td> de Pipeta a <td>Granel de Propileno</td><td>Vertex 4330N00</td></tr><tr><td>(200 &micro; L)</td> <td>Vertex</td><td>4230N00</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de células de propileno (96 poços)</td> <td>SPL</td><td>300096</td><td>poliestireno, centrífuga tipo fundo plano</td></tr><tr><td>(com rotor de 1,5-2 mL do tamanho de um tubo)</td> <td>Eppendorf</td><td>5424 R</td><td>Centrífuga refrigerada de ângulo fixo</td></tr><tr><td>(com rotor de 5 mL do tamanho de um tubo)</td> <td>Eppendorf</td><td>5425 R</td><td>Colher química refrigerada de ângulo fixo</td></tr> <tr><td></td><td>-</td><td>- </td><td>Sistema de imagem</td></tr><tr><td>ChemiDoc</td> de aço inoxidável Sistema de <td>imagem de Western blot</td><td>Biorad</td><td>12003153</td></tr><tr><td>CO2 fly pad</td><td>-</td><td>-</td><td>Placa anestésica</td></tr><tr><td>CO2 tanque & regulador</td>-<td></td><td>-</td><td>Cuidado de gás de alta pressão & tontura</td></tr><tr><td>Incubadora compacta</td><td>JSR</td><td>JSGI-10T</td><td>Cuidado de alta </td></tr><tr><td>Microscópio de varredura a laser confocal</td><td>de temperatura Zeiss</td><td>LSM 710</td><td>Cuidado com feixe de laser intenso</td></tr><tr><td>Tubo cônico (15 mL)</td><td>SPL</td><td>50015</td><td>Polipropileno /Polietileno de alta densidade&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubo cônico (50 mL)</td><td>SPL</td><td>50050</td><td>Polipropileno /Polietileno de alta densidade&nbsp;</td></tr><tr><td>Balança digital</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Temporizador digital</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Prato de dissecação</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de #5SF de silicone Dumont&nbsp;</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>11252-00</td><td>Pontas super finas, cuidado com objeto pontiagudo</td></tr><tr><td>Ímã DynaMag-2</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>Para tubos de microcentrífuga de 1,5-2 mL Tamanho</td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Lâminas de microscópio Superfrost Plus (25 mm x 75 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>Cuidado com objetos pontiagudos</td></tr><tr><td>Garrafas de comida para moscas (com plugue de papel)</td>Frascos de comida para moscas <td>Hansol Tech</td><td>FFB-21010-Fly</td><td></td></tr> <tr><td>(com tampa de algodão)</td><td>Hansol Tech</td><td>FFV-11010-Ultrasonicator</td><td></td></tr> focado <tr><td></td><td>Covaris</td><td>M220</td><td>Cuidado com a onda ultrassônica</td></tr><tr><td>Faca de gel</td><td>Invitrogen</td><td>EI9010</td><td>Aço inoxidável com cabo de plástico</td></tr><tr><td>Grau 3MM Papel mata-borrão Chr (46 cm e 57 cm)</td><td>Cytiva</td><td>3030-917</td><td>Papel Whatmann</td></tr><tr><td>Homogeneizador manual e pilão de plástico</td><td>Kimble</td><td>749540-0000</td><td>Motor sem fio</td></tr><tr><td>Bloco de calor</td><td></td><td>PCR fino ALB6400</td><td>Cuidado com alta temperatura</td></tr><tr><td>Tecido sem fiapos</td><td>Yuhan-Kimberly</td><td>41112</td><td>- </td></tr><tr><td>Nitrogênio líquido</td> <td>-</td><td></td> <td>Cuidado com queimaduras e queimaduras</td></tr><tr><td>Espectrofotômetro de microplacas</td><td>Agilent Technologies</td><td>Epoch</td><td>Óptica baseada em monocromador</td></tr><tr><td>Microondas</td> <td>-</td><td></td> <td>Cuidado com</td></tr><tr><td>miliTUBE de alta temperatura 1 mL AFA fibra</td><td>Covaris</td><td>PN 520135</td><td>Mini</td></tr><tr><td>tanque de gel Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A25977</td><td>Cuidado com</td></tr><tr><td>os géis de proteína NuPAGE Bis-tris mini de alta temperatura, 4&ndash; 12%, 1,0&ndash; 1,5 mm, 10 poços</td><td>Invitrogen</td><td>NP0323BOX</td><td>Contém poliacrilamida, cuidado de toxicidade</td></tr><tr><td>NuPAGE Bis-tris mini géis de proteína, 4&ndash; 12%, 1,0&ndash; 1,5 mm, 15 poços</td><td>Invitrogen</td><td>NP0321BOX</td><td>Contém poliacrilamida, cuidado com a toxicidade</td></tr><tr><td>Pincel (&Oslash; 1,8 mm)</td><td>Hwa hong</td><td>791240-Pipetman</td><td></td></tr> <tr><td>L (P1000L)</td><td>Gilson</td><td>FA10006M</td><td>Micropipeta monocanal com ejetor de metal</td></tr><tr><td>Pipetman L (P200L)</td><td>Gilson</td><td>FA10005M</td><td>Micropipeta monocanal com ejetor de metal</td></tr><tr><td>Pipetman L ( P20L)</td><td>Gilson</td><td>FA10003M</td><td>Micropipeta de canal único com ejetor de metal</td></tr><tr><td>Pipetman L (P2L)</td><td>Gilson</td><td>FA10001M</td><td>Micropipeta de canal único com ejetor de metal</td></tr><tr><td>Fonte de alimentação</td><td>Ciência principal</td><td>MP-310</td><td>Cuidado com eletricidade de alta tensão</td></tr><tr><td>Rotador programável</td><td>Biosan</td><td>RS-24-Protein</td><td></td></tr> <tr><td>LoBind&nbsp; tubos</td><td>Eppendorf</td><td></td> <td>30108302-Lâmina</td></tr> <tr><td>de barbear</td><td>Dorco</td><td>304020</td><td>Aço inoxidável, cuidado com objeto pontiagudo</td></tr><tr><td>Rolo</td><td>-</td><td>-</td><td>-Pipeta</td></tr> <tr><td>sorológica (10 mL)</td><td>SPL</td><td>91010</td> Pipeta sorológica <td>de poliestireno</td></tr><tr><td>(25 mL)</td><td>SPL</td><td>91025</td> Pipeta sorológica <td>de poliestireno</td></tr><tr><td>(5 mL)</td><td>SPL</td><td>91005</td> Pipeta sorológica <td>de poliestireno</td></tr><tr><td>(50 mL)</td><td>SPL</td><td>91050</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de baixa retenção de poliestireno Snap cap (1,5 mL)</td>Esponja de <td>polipropileno</td> <td>Thermo Scientific</td><td>3451PK</td></tr><tr><td></td><td>Invitrogen</td><td>EI9052-Microscópio</td><td></td></tr> <tr><td>estéreo</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 508-Microscópio</td><td></td></tr> <tr><td>estéreo&nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer&nbsp; C</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td>Com blocos de 1,5 e 5 mL</td></tr><tr><td>Pinça</td><td>Aven Tools</td><td>18526</td><td>Plástico, pontas planas</td></tr><tr><td>Misturador de vórtice</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236-XCell</td><td></td></tr> <tr><td>II Módulo de borrão</td><td>Invitrogen</td><td>EI9051</td><td>Cuidado com a alta temperatura</td></tr><tr><td>XCell&nbsp; Minicélula SureLock</td><td>Invitrogen</td><td>EI0001</td><td>Cuidado com alta temperatura</td></tr><tr><td><forte>Produtos químicos</forte></td><td><forte>Empresa</forte></td><td><forte>Número de catálogo</td><td>Comentários/Descrição</td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650501</td><td>Grau analítico</td></tr><tr><td>Acetonitrila</td><td>Supelco</td><td>1.00029.1000</td><td>Grau LC-MS, cuidado com a toxicidade por inalação e</td></tr><tr><td>ampolas padrão de albumina inflamáveis (contendo albumina de soro bovino (BSA) a 2 mg/mL em solução salina a 0,9% e azida de sódio a 0,05%)</td><td>Parte Thermo Scientific</td><td>23209</td><td>dos kits de ensaio de proteína Pierce BCA (Thermo Scientific, 23225)</td></tr><tr><td>Albumina, soro bovino</td><td>Bioshop</td><td>ALB001</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de amônio</td> de grau analítico <td>Sigma-Aldrich</td><td>09830</td><td>Biotina de grau analítico</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4639</td><td>Grau de cultura de células e tecidos</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio (CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td>Grau de cultura de células</td></tr><tr><td>Clareza substrato de ECL ocidental</td><td>Biorad</td><td>1705060</td><td>Grau analítico</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MBD0015</td> Ditiotreitol (DTT)Thermo sensível à <td>luz, grau analítico</td></tr><tr><td></td><td> Fisher Scientific</td><td>R0861</td><td>Grau analítico</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>Corning</td><td>35-015-CV</td><td>Grau de cultura de células</td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0507</td><td>Grau de reagente, cuidado de toxicidade por inalação Meio de inseto</td></tr><tr><td>de Grace</td><td>Gibco</td><td>11595030</td><td>Grau de cultura de células</td></tr><tr><td>Fermento seco instantâneo</td><td>Não Marca</td><td>N1019</td><td>-</td></tr><tr><td>Iodoacetamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1149</td> Metanol <td>de grau analítico sensível à luz</td></tr><tr><td></td><td>Carlo Erba</td><td>41484</td><td>Esmalte de unhas de grau analítico</td></tr> - <tr><td>Tampão de amostra Novex Tris-glicina SDS</td> de tipo transparente (2X) <td>Invitrogen</td><td>LC2676</td><td>Grau analítico</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X)</td> <td>Invitrogen</td><td>NP0001</td><td>PageRuler</td></tr><tr><td>De grau analítico Escada de proteína pré-fabricada</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26616</td><td>Grau analítico</td></tr><tr><td>Fluoreto de fenilmetanossulfonil&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>36978</td><td>Grau analítico</td></tr><tr><td>Tampão fosfato salino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>Grau analítico</td></tr><tr><td>Pierce 16% Formaldeído (w/v)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td><td>Grau analítico, sensível à luz</td></tr><tr><td>Pierce BCA kits de ensaio de proteína Thermo</td><td>Scientific</td><td>23225</td><td>Grau analítico</td></tr><tr><td>Reagente Pierce BCA A (contendo carbonato de sódio, bicarbonato de sódio, ácido bicinconínico e tartarato de sódio em hidróxido de sódio 0,1 M)</td><td>Parte Thermo Scientific</td><td>23228</td><td>dos Kits de Ensaio de Proteína Pierce BCA (Thermo Scientific, 23225)</td></tr><tr><td>Reagente B Pierce BCA (contendo 4% de sulfato cúprico)</td><td>Parte 1859078 Thermo Scientific</td><td></td><td>dos Kits de Ensaio de Proteína Pierce BCA (Thermo Scientific, 23225)</td></tr><tr><td>Ácido propiônico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>402907</td><td>Conjunto</td></tr><tr><td>de cocktail de inibidor de protease de</td> grau ACS III <td>Calbiochem</td><td>539134</td><td>Grau de cultura de células e tecidos</td></tr><tr><td>SlowFade Gold Antifade Mountant Invitrogen</td><td></td><td>S36936</td> Cloreto <td>de</td></tr><tr><td>sódio (NaCl)</td><td>Bioneer</td><td>C-9025</td><td>Grau analítico</td></tr><tr><td>Desoxicolato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td>Grau analítico</td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71736</td> Hidróxido de sódio <td>de grau molecular</td></tr><tr><td>(NaOH)</td><td>Biosesang</td><td>SR2018-100-00</td><td>Grau analítico</td></tr><tr><td>Água tripla destilada</td> <td>-</td><td></td> <td>Ultrapuro (tipo 1)</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>94158</td><td>Tampão</td></tr><tr><td>de transferência de trisglicina</td> de grau analítico <td>Koma Biotech</td><td>K0341001</td><td>Grau analítico</td></tr><tr><td>Tris-HCl, pH 8</td><td>Bioneer</td><td>C-9006</td><td>Grau analítico</td></tr><tr><td>Triton x-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93443</td><td>Grau molecular</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20233</td><td>Grau de cultura de células</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td>Grau molecular</td></tr><tr><td></td><td>Ureia Sigma-Aldrich</td><td>U5378</td><td>Molecular & Grau de cultura de células</td></tr></tbody></table>

in vivo aplicação da rotulagem de proximidade baseada em turboid em drosophila melanogaster

In Vivo Application of TurboID-based Proximity Labeling in Drosophila melanogaster

Os exemplos de resultados são representados na Figura 1, Figura 2, Figura 3, Figura 4 foram publicados anteriormente por Nguyen et al.20. A Figura 1 ilustra o procedimento experimental de PL baseado em TurboID no ovário de Drosophila. Primeiro, foi gerada uma construção combinando Zuc e TurboID (Zuc-V5-TurboI...

In vivo Aplicação da rotulagem de proximidade baseada em TurboID em Drosophila melanogaster

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Na Vivo Único-molécula de rastreamento no Terminal do nervo Motor pré-sináptica da drosófila

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