Name: Farmacologia de Rede e Validação dos Mecanismos Antidepressivos de Qiangzhifang em um Modelo de Rato de Depressão Induzida por Estresse de Contenção Crônica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-06T15:25:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Descubra a farmacologia de rede e validação dos mecanismos antidepressivos de Qiangzhifang em modelo de rato com depressão induzida por estresse de contenção crônica. Este método auxilia pesquisadores a estudar vias de HIF-1 e JAK-STAT.

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Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentos Animais da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Shandong (número de aprovação: YYLW2023000327) e obedeceram ao Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório emitido pelos Institutos Nacionais de Saúde. Neste experimento, foram utilizados 40 ratos Wistar machos, saudáveis, grau FPS, com peso corporal médio de (140 ± 10) g (Figura 1). Consulte a Tabela de Materiais para obter uma lista de todos os materiais, equipamentos e software usados neste protocolo.
1. Modelo de depressão de rato
<ol>
	<li>Alojamento e agrupamento de animais<ol>
		<li>Entre na sala de criação com os animais e numere-os usando um instrumento de marcação de cauda.</li>
		<li>Aloje os ratos individualmente em gaiolas, mantendo uma temperatura de 21 ± 2 °C e um ciclo claro/escuro de 12 h/12 h.</li>
		<li>Aclimatar os ratos em laboratório por 7 dias, proporcionando acesso ad libitum a comida e água enquanto os manuseia diariamente para adaptação.</li>
		<li>Após o período de aclimatação, medir o peso corporal e realizar os testes de preferência de sacarose (SPT) e testes de campo aberto (OFT).</li>
		<li>Com base nos dados experimentais, divida os ratos em quatro grupos, garantindo que cada grupo seja composto por 10 ratos: o grupo controle (CON), o grupo modelo (CRS), o grupo QZF e o grupo fluoxetina (F).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Estabelecimento de um modelo de rato de Estresse de Contenção Crônica (CRS)<ol>
		<li>Construa o dispositivo de retenção de ratos. Selecione um tubo de plástico transparente com diâmetro e comprimento adequados ao tamanho21 do rato, permitindo que o rato fique de pé e vire para dentro, evitando a fuga. Use um furador elétrico de ferro de solda para criar furos nas laterais do tubo de plástico e na tampa para garantir a circulação de ar adequada.</li>
		<li>Coloque suavemente os ratos nos dispositivos de contenção (exceto os do Grupo C) 1 h após a administração intragástrica diária do medicamento, garantindo que estejam em uma posição confortável.</li>
		<li>Prive todos os grupos de ratos de comida e água durante o período de contenção. Após o término do período de contenção, forneça-lhes comida e água suficientes uniformemente. Fixe a duração diária da contenção em 6 h (das 9:30 h às 15:30 h) e mantenha-a por 28 dias consecutivos.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Intervenção medicamentosa
<ol>
	<li>Administrar via gavagem: 1 mL de solução/100 g de peso corporal, fluoxetina (2,7 mg·kg-1·dia-1) e QZF (2 g·kg-1·dia-1)22. Forneça aos Grupos C e SRC solução salina normal equivalente para controle de variável única. NOTA: A administração diária do medicamento foi realizada às 08:00 h, iniciando-se de forma síncrona com o estabelecimento do modelo e persistindo durante todo o período de modelagem de 28 dias.</li>
</ol>
3. Teste de preferência de sacarose (SPT)
<ol>
	<li>Prive os ratos de comida e água por 24 horas antes do início do experimento.</li>
	<li>Preparar uma solução aquosa de sacarose a 1% e encher a solução e a água pura nos bebedouros dos animais experimentais para pesagem. Meça o consumo de água pura e água de sacarose pesando as garrafas antes e depois do experimento.</li>
	<li>Coloque uma garrafa de solução de sacarose e uma garrafa de água pura na entrada de água de cada tampa da gaiola de rato, uma à esquerda e outra à direita, para livre acesso à bebida. Para evitar que os ratos favoreçam um lado para a ingestão de água, troque as posições das garrafas de água à esquerda e à direita após 30 minutos do experimento.</li>
	<li>Após 1 h do experimento, remova todas as garrafas de água, pese-as prontamente e registre o consumo de solução de sacarose e água pura. Calcule a taxa semanal de preferência por sacarose usando a fórmula: Valor de preferência de sacarose = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/68198/68198eq001.jpg" style="margin: auto;"> × 100%</li>
</ol>
4. Medição do peso corporal
<ol>
	<li>Pesar os ratos semanalmente após a entrada no laboratório e definir o horário fixo para a pesagem às 7:00 da manhã. Estabeleça este esquema para facilitar a observação das mudanças de peso corporal.</li>
</ol>
5. Ensaio em campo aberto (OFT)
<ol>
	<li>Antes do início do experimento, aclimatar os ratos à sala comportamental por 1 h e ajustar a iluminação na caixa de campo aberto para garantir uma distribuição uniforme. Confirme se os ratos estão claramente visíveis no software de rastreamento.</li>
	<li>Utilize o sistema de rastreamento e análise de vídeo para dividir a superfície inferior da caixa de campo aberto (50 cm x 50 cm x 50 cm) em nove grades quadradas de área igual. Designe as oito grades adjacentes às paredes como a área periférica e a grade central como a área central.</li>
	<li>Coloque o rato na área central da caixa de campo aberto. Grave o movimento do rato por 5 minutos usando o sistema de rastreamento de vídeo.</li>
	<li>Depois de testar cada rato, limpe a câmara com etanol a 75% para remover o odor residual e evitar interferência no comportamento do próximo rato. Insira a distância total (mm) das atividades em campo aberto e o número de entradas na grade central nos registros OFT.</li>
</ol>
6. Teste de nado forçado (FST)
NOTA: O experimento de nado forçado com ratos compreende um pré-experimento e um experimento formal. Realizar o pré-experimento 24 h antes do experimento formal, seguindo o mesmo procedimento, com o rato nadando por 15 min.
<ol>
	<li>Transporte os animais experimentais para a sala comportamental pelo menos 30 minutos antes do experimento para permitir que eles se aclimatem ao ambiente.</li>
	<li>Prepare um cilindro cilíndrico transparente de água de plexiglass (50 cm de altura e 20 cm de diâmetro) e encha-o com água a 23-25 °C. Ajuste a profundidade da água com base no peso do animal, garantindo que a cauda do animal permaneça a uma certa distância do fundo do cilindro.</li>
	<li>Coloque lentamente os ratos no cilindro de água e fique quieto durante todo o experimento. Ative a câmera e o sistema de aquisição de sinal. Observe e registre a duração da imobilidade flutuante dentro de 300 s. Retire imediatamente os ratos da água e seque-os no final do experimento.</li>
	<li>Após cada sessão, substitua a água para evitar qualquer influência no próximo rato.</li>
</ol>
7. Predição farmacológica em rede
<ol>
	<li>Coleção de compostos QZF e alvos putativos<ol>
		<li>Acesse o banco de dados de Farmacologia de Sistemas de Medicina Tradicional Chinesa (TCMSP) (https://old.tcmsp-e.com/)23, o banco de dados HERB24 e o banco de dados TCMID (https://www.bidd.group/TCMID/). Use os oito nomes TCM em QZF, incluindo GZ, YZ, YZR, BS, CBM, RS, HJT e ZGC, como palavras-chave para pesquisar compostos ativos e alvos das ervas. Colete alvos do TCMSP e da previsão de alvo suíço (http://www.swisstargetprediction.ch/). Defina o valor do filtro como Probabilidade* &gt; 0. NOTA: Normalmente, os ingredientes foram incluídos como ingredientes ativos com base em suas características farmacocinéticas: biodisponibilidade oral (OB) ≥ 30% e características semelhantes a medicamentos (DL) ≥ 0,1825.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Previsão de alvos de doenças<ol>
		<li>Pesquise a palavra-chave "depressão" no banco de dados GeneCards (https://www.genecards.org/), obtenha alvos genéticos associados à depressão, baixe a planilha eletrônica de alvos de doenças, filtre os escores genéticos superiores ao valor médio e compile uma lista de alvos de depressão26.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rede de drogas-componente-doença-alvo<ol>
		<li>Crie uma nova planilha e preencha-a com alvos relacionados à depressão e alvos de medicamentos na mesma coluna. Clique em Iniciar na barra de menu | Formatação condicional | Regras de Células de Destaque | Valores duplicados. Selecione um formato (por exemplo, "Preenchimento Vermelho Claro") na caixa de diálogo que aparece27, clique em OK para exibir os resultados.</li>
		<li>Inicie o software de análise de rede e importe o arquivo da planilha clicando em Arquivo na barra de menu | Importação | Rede. Otimize a aparência da rede ajustando o tamanho e a cor dos nós no painel Estilo localizado no painel de controle esquerdo. Execute a análise de topologia de rede clicando em Ferramentas na barra de menus | Analise a Rede27.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rede de interação proteína-proteína (PPI)<ol>
		<li>Acesse a ferramenta Jvenn (https://jvenn.toulouse.inrae.fr/app/example.html), carregue os alvos compostos e os alvos da doença separadamente, plote os Genes Sobrepostos (OGE) entre os alvos presumidos compostos e os alvos da doença. Clique nos números da imagem e copie-os para uma planilha e baixe a imagem do diagrama de Venn.</li>
		<li>Acesse o banco de dados STRING (https://stringdb.org/)28 e insira os OGEs da planilha no banco de dados. Especificamente, cole a lista de alvos sobrepostos de anti-depressão QZF na caixa de diálogo Lista de nomes . Selecione Homo sapiens na seção Organismos e clique em PESQUISAR | CONTINUAR. Selecione a opção Exportações na barra de título e baixe a tabela de resumo da rede PPI nos formatos PNG e TSV29.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Triagem de proteínas centrais<ol>
		<li>Inicie o software de análise de rede (https://cytoscape.org/). Em seguida, na barra de menu, clique em Arquivo | Importação | Rede | File para importar o arquivo de formato TSV gerado na etapa30 anterior.</li>
		<li>Selecione Analisar rede na barra de menus e clique no botão Analisar . Em seguida, visualize os resultados da análise e entenda as características estruturais gerais da rede, como o número de nós, o número de bordas e o grau médio.</li>
		<li>Aplicativos selecionados | Gerenciador de aplicativos na barra de menus. Procure MCODE, instale o plug-in e execute o plug-in para obter o destino do hub. Em seguida, procure por CytoNCA, instale o plug-in e concentre-se nos três valores de parâmetro de Grau, Centralidade de proximidade (CC) e Centralidade de intermediação (BC). De acordo com os valores desses parâmetros, rastreie os nós com maior grau, CC e BC, que geralmente são considerados proteínas centrais31.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Análise de enriquecimento da Ontologia Gênica (GO) e da Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (KEGG)<ol>
		<li>Abra a plataforma de bioinformática (https://www.omicshare.com/). Clique no menu Ferramentas , encontre a ferramenta de conversão de genes de identificação e clique nela. Em seguida, clique no botão de upload de arquivo , selecione a etapa gerada no núcleo dos genes-alvo e baixe a lista de IDs de arquivo convertida.</li>
		<li>No menu Ferramentas , clique na ferramenta Análise de enriquecimento KEGG dinâmico . Carregue a lista de ID do gene. Na opção Espécie , selecione Homo sapiens e clique no botão Enviar .</li>
		<li>No menu Ferramentas, clique na ferramenta Análise de enriquecimento GO dinâmico | Opção de gene | Opção de upload de arquivo. Selecione a lista de ID do gene e, na opção Espécie, selecione Homo sapiens. Selecione o tipo de GO para análise, incluindo Processo Biológico, Função Molecular e Componente Celular.</li>
		<li>Para os resultados da análise de enriquecimento KEGG e GO, defina o limite de filtragem como p &lt; 0,05. Organize as contagens em ordem decrescente.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. Verificação de encaixe molecular
<ol>
	<li>Visite o site do PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/). Digite os compostos alvo na barra de pesquisa. Clique na Estrutura 2D e faça o download.</li>
	<li>Abra o banco de dados PDB (https://www.Rcsb.org/). Selecione a estrutura cristalina com alta resolução e contendo o ligante original. Faça download do arquivo PDB.</li>
	<li>Para otimizar a estrutura da proteína, abra o software de visualização molecular. Carregue o arquivo PDB baixado. Remova as moléculas de água e salve o arquivo PDB otimizado.</li>
	<li>Abra o software de encaixe molecular e importe o arquivo PDB otimizado. No AutoDockTools, clique em Editar | Excluir Água para excluir moléculas de água. Clique em Editar | Adicionar hidrogênios | Adicione para adicionar átomos de hidrogênio à proteína e ao ligante29.</li>
	<li>No AutoDockTools, defina a barra receptora como receptor.pdbqt e a barra de ligante como ligand.pdbqt. Abra o arquivo pdbqt. file para visualizar os locais de ligação da proteína e do ligante e definir o tamanho e a posição da caixa de encaixe para garantir que ela possa envolver completamente a proteína receptora e o composto ligante. No AutoDockTools, clique em Grid | Defina a caixa de grade para definir as coordenadas e dimensões centrais da caixa e usar valores padrão para encaixe molecular. Os quadros de encaixe serão classificados automaticamente em ordem decrescente de energias de ligação.</li>
	<li>Abra o arquivo de resultados e registre o valor ideal da energia de ligação. Energias de ligação mais baixas indicam ligação mais estável. Use o software de visualização molecular para carregar o arquivo de resultados. Ajuste a visualização e a cor para exibir claramente a interação ligante-receptor.</li>
</ol>
9. Análise estatística
<ol>
	<li>Realize análises estatísticas no software de análise e visualização de dados científicos e represente todos os dados como a média ± SEM. Use ANOVA bidirecional de medidas repetidas para comparações entre grupos antes e depois da administração do medicamento. Empregue ANOVA unidirecional para comparações entre mais de dois grupos.</li>
	<li>Considere o valor de P &lt; 0,05 como estatisticamente significativo.</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Sistema de análise do comportamento animal</td><td>Xangai Xinsoft Tecnologia da Informação Co., LTD</td><td>XR-SuperMaze</td><td></td></tr><tr><td>Ferramentas de encaixe automático</td><td>O Instituto de Pesquisa Scripps</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytoscape&nbsp; software</td><td>Consórcio Cytoscape</td><td>Versão 3.7.2</td><td></td></tr><tr><td>Perfurador elétrico do furo do ferro de solda</td><td>Nanjing Naiwei Technology Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoxetina</td><td>Lilly Suzhou Farmacêutica Co., LTD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema experimental de campo aberto</td><td>Xangai Xinsoft Tecnologia da Informação Co., LTD</td><td>XR-XZ301</td><td></td></tr><tr><td>PyMol</td><td>Schr&ouml; Dinger</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qiangzhifang&nbsp;</td><td>Hospital Afiliado da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Shandong, Jinan, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo de plástico transparente&nbsp;</td><td>Nantong Baiyang Plastic Products Co., Ltd.&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

farmacologia de rede e validação dos mecanismos antidepressivos de qiangzhifang em um modelo de rato de depressão induzida por estresse de contenção crônica

Network Pharmacology and Validation of the Antidepressant Mechanisms of Qiangzhifang in a Chronic Restraint Stress-induced Depression Rat Model

Resultados de testes comportamentais no modelo de depressão de ratos induzida por RSC 
Resultados do teste de preferência de sacarose No início do estudo, não houve diferença no coeficiente de preferência por sacarose entre os grupos (P &gt; 0,05). Após 28 dias de intervenção, o coeficiente de preferência pela sacarose do grupo RSC foi significativamente menor do que o do grupo CON (P &lt; 0,05), enquanto os grupos F e QZF apresentaram coe...

Farmacologia de Rede e Validação dos Mecanismos Antidepressivos de Qiangzhifang em um Modelo de Rato de Depressão Induzida por Estresse de Contenção Crônica

Depression is a complex psychiatric disorder that poses significant treatment challenges.Qiangzhifang (QZF), a compound used in traditional Chinese ...

Esta pesquisa tem como objetivo investigar como o Qiangzhifang atua contra a depressão, identificar os principais ingredientes ativos e entender seus mecanismos de ação. Este estudo preenche a lacuna na compreensão dos mecanismos específicos e componentes ativos do Qiangzhifang para rastrear a depressão.Estudaremos como o Qiangzhifang afeta o sistema imunológico para encontrar a depressão e explorar suas potenciais novas aplicações terapêuticas.[Narrador] Para começar, construa o dispositivo de contenção de ratos selecionando um tubo de plástico transparente com diâmetro e comprimento adequados ao tamanho do rato, permitindo que o rato fique de pé e vire para dentro, evitando a fuga. Usando um furador de ferro de solda elétrico, faça furos nas laterais do tubo de plástico e na tampa para garantir a circulação de ar adequada. Divida os ratos em quatro grupos, garantindo que cada grupo seja composto por 10 ratos. Uma hora após a administração intragástrica diária do medicamento, coloque suavemente os ratos nos dispositivos de contenção, excluindo os do grupo controle, e certifique-se de que estejam em uma posição confortável. Administre fluoxetina a 2,7 miligramas por quilograma por dia ao Grupo Fluoxetina e Qiangzhifang a dois gramas por quilograma por dia ao Grupo Qiangzhifang via gavagem usando um volume de dosagem de um mililitro por 100 gramas de peso corporal para ambas as soluções. Encha os bebedouros dos animais experimentais com água pura ou uma solução aquosa de sacarose a 1%. Colocar cada solução num frasco separado e, em seguida, pesar os frascos. Coloque uma garrafa de solução de sacarose e uma garrafa de água pura na ingestão de água de cada gaiola de rato. Um à esquerda e outro à direita para livre acesso à bebida. Após 30 minutos, troque as posições das garrafas para evitar a preferência lateral. Após uma hora, remova todas as garrafas de água. Pese-os prontamente para medir os valores de consumo de ambas as soluções. Em seguida, calcule a taxa de preferência semanal por sacarose usando a equação fornecida. Pese os ratos semanalmente em um horário fixo de sete da manhã. Para monitorar as mudanças no peso corporal. Ajuste a iluminação na caixa de campo aberto para distribuição uniforme e visibilidade clara dos ratos no software de rastreamento. Use o sistema de rastreamento e análise de vídeo para dividir a superfície inferior da caixa de campo aberto em nove grades quadradas iguais com oito grades adjacentes às paredes como área periférica e o centro como área central. Coloque o rato na área central da caixa de campo aberto e registre seu movimento por cinco minutos usando o sistema de rastreamento. Depois de testar cada rato, limpe a câmara de campo aberto com etanol a 75% para remover o odor residual e evitar interferência no comportamento do próximo rato. Insira a distância total das atividades de campo aberto e o número de entradas na grade central nos registros de teste de campo aberto. Pegue um cilindro de água de plexiglass transparente e encha-o com água a uma temperatura de 23 a 25 graus Celsius. Ajuste a profundidade da água de acordo com o peso do animal, garantindo que a cauda do rato fique a uma certa distância acima do fundo. Após ativar a câmera e o sistema de aquisição de sinal, coloque lentamente os ratos no cilindro de água, mantendo silêncio durante todo o experimento. Observe e registre a duração da imobilidade flutuante em 300 segundos. No final da sessão, retire imediatamente os ratos da água e seque-os. Após cada sessão, substitua a água no cilindro para evitar qualquer influência no próximo rato. Access, o banco de dados de farmacologia dos sistemas de medicina tradicional chinesa ou TCMSP, o banco de dados de ervas e o banco de dados TCMID. Use os nomes dos oito medicamentos tradicionais chineses em Qiangzhifang como palavras-chave para pesquisar compostos ativos e alvos das ervas. Colete informações de alvo do TCMSP e do banco de dados de previsão de alvo suíço. Definir o valor do filtro como probabilidade maior que zero. Agora navegue até o banco de dados GeneCards e pesquise a palavra-chave depression. Depois de obter os alvos genéticos associados à depressão, baixe a planilha eletrônica, filtre as pontuações genéticas mais altas que a média e compile uma lista de alvos relacionados à depressão. Agora acesse a ferramenta gen e carregue os alvos compostos seguidos dos arquivos Target da doença. Plote os genes sobrepostos entre os alvos presumidos compostos e os alvos da doença. Em seguida, baixe a imagem do diagrama. Por fim, acesse o banco de dados String e cole os genes sobrepostos, especificamente a lista de alvos sobrepostos anti-depressão Qiangzhifang na caixa de diálogo da lista de nomes. Selecione homo sapiens na seção do organismo e clique em Pesquisar, seguido de Continuar. Selecione a opção de exportação na barra de título e baixe a tabela de resumo da Rede de Interação Proteína-Proteína nos formatos PNG e TSV. No teste de preferência por sacarose após 28 dias, o grupo de estresse de contenção crônica teve preferência por sacarose significativamente menor do que o controle. Enquanto os grupos tratados com Qiangzhifang e Fluoxetina apresentaram valores significativamente mais altos em comparação com o grupo de estresse. O ganho de peso corporal foi significativamente reduzido no grupo de estresse crônico em comparação com o controle após 28 dias, mas aumentou significativamente nos grupos Qiangzhifang e fluoxetina em comparação com o grupo de estresse. Os gráficos de movimento em campo aberto mostraram exploração reduzida da área central no grupo de estresse. Enquanto ambos os grupos de tratamento exibiram atividade visivelmente mais central. Distância total percorrida em O teste de campo aberto não mostrou diferenças significativas entre todos os grupos. O tempo na área central também foi significativamente reduzido no grupo de estresse e aumentou significativamente em ambos os grupos de tratamento. Além disso, o tempo de imobilidade no teste de nado forçado foi maior no grupo de estresse e reduziu significativamente com ambos os tratamentos.

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