Name: Ensaio imunoquímico validado para determinação abrangente do receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano liberado e ligado às células (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Aprenda a realizar um ensaio ELISA sandwich validado para quantificação precisa do HER2 em células cultivadas e amostras de pacientes. Este método utiliza anticorpos monoclonais anti-HER2 para diagnóstico e pesquisa oncológica.

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1. Cultura de células cancerígenas humanas
<ol><li>Cultura de linhagens MDA-MB-231, SK-BR-3 e SK-OV-3 em meio de Dulbecco Modified Eagle contendo 4,5 g/L de ᴅ-glicose (DMEM-HG), suplementado com 2 mM de ʟ-glutamina e 10% (v/v) de FBS inativado por calor. Incubar culturas a 37 °C em uma atmosfera umidificada de 5% de CO2.</li>
	<li>Quando a cultura atingir ~ 80% de confluência, desprenda as células por tripsinização e colete-as em tubos cônicos separados de 15 mL.</li>
	<li>Conte as células com um contador automático de células e células-semente para o experimento em placas de 12 poços a uma densidade de 3 × 105 células/por poço em 1 mL de meio de crescimento. Incubar culturas a 37 °C em uma atmosfera umidificada de 5% de CO2. NOTA: Semeie um poço por cada ponto de tempo do experimento. Tanto o meio pós-cultura quanto os lisados celulares serão usados em análises posteriores.</li>
</ol>2. Coleta e preparação de amostras
<ol><li>A partir da cultura de 24 horas, colete o meio de cultura de um poço de cada linha celular em um tubo de 1,5 mL.</li>
	<li>Centrifugar as amostras recolhidas a 10 000 × g durante 10 min a 4 °C. Transfira o sobrenadante para um novo tubo e armazene a -20 °C para determinar melhor o nível de ECD HER2 secretado.</li>
	<li>Lave as células restantes na placa com 1 mL de PBS frio, aspire suavemente e descarte o PBS.</li>
	<li>Adicione 200 μL de tampão RIPA (suplementado com 1% de inibidor de protease) em cada poço e incube por 5 min. Raspe as células com o raspador de células e misture pipetando várias vezes para homogeneizar o lisado.</li>
	<li>Colete as células lisadas em um novo tubo e aspire lentamente em uma seringa de 2 mL com uma agulha (G21 / 0,8 mm × 40 mm). Repita a etapa de aspiração 5 a 10 vezes para desintegrar ainda mais as células.</li>
	<li>Centrifugar as amostras recolhidas a 10 000 x g durante 10 min a 4 °C. Transferir o sobrenadante para um novo tubo e conservá-lo a -20 °C para posterior determinação da fracção ligada às células da proteína HER2.</li>
	<li>Repita a coleta de meio de cultura e materiais celulares, seguindo as etapas de preparação para os pontos de tempo restantes - 48 h e 72 h de cultura.</li>
</ol>3. Realizando um ELISA sanduíche para determinação de HER2
<ol><li>Prepare os buffers.<ol><li>Tampão de revestimento: Prepare a solução de NaHCO3 0,1 M dissolvendo 0,42 g de NaHCO3 em 50 mL de água destilada e misture bem. Ajuste o pH para 9,6 com NaOH 3 M.</li>
		<li>Tampão de bloqueio: Prepare 5% de leite desnatado (NFDM) em PBS adicionando 0,5 g de leite em pó a 10 mL de PBS e misture bem.</li>
		<li>Tampão de lavagem: Prepare solução salina tamponada com fosfato com Tween 20 (PBST) adicionando 0,5 mL de Tween-20 a 1000 mL de PBS a 0,05% e misture (evite espuma excessiva).</li>
	</ol></li>
	<li>Biotinilar o anticorpo de detecção.<ol><li>Biotinilato 50-200 μg de detecção de anticorpo anti-HER2 (clone 70.21.73.67) usando um kit comercial de rotulagem de biotina de acordo com as instruções do fabricante. NOTA: A confiabilidade e a repetibilidade do processo de biotinilação são baseadas na medição da concentração final de proteína do anticorpo resultante e na comparação lote a lote do produto.</li>
	</ol></li>
	<li>Cubra o prato.<ol><li>Diluir o anticorpo de captura anti-HER2 (clone 70.27.58) até à concentração de 1 μg/ml no tampão de revestimento. Para revestir uma placa, use 6,5 mL da solução de anticorpo de captura.</li>
		<li>Utilizando uma pipeta multicanal, adicionar 100 μL da solução de anticorpos de captura (preparada no passo 3.3.1) a cada alvéolo numa placa ELISA de 96 poços. NOTA: Evite os poços mais externos da placa (por exemplo, A1, H12) para reduzir a variabilidade causada pelo efeito de borda. Os poços mais externos devem ser preenchidos com água destilada para garantir condições de reação estáveis.</li>
		<li>Cubra a placa com uma película de vedação.</li>
		<li>Incubar a placa durante a noite (O/N) a 4 °C.</li>
		<li>Após a incubação O/N, colocar a placa à temperatura ambiente (RT) num agitador horizontal de microplacas (20-30 rpm com um ângulo de inclinação de 4°-6°) durante 1 h.</li>
		<li>Usando uma lavadora de microplacas, aspire a solução de revestimento e lave a placa três vezes com um tampão de lavagem (3 x 300 μL de PBST por poço).</li>
	</ol></li>
	<li>Bloqueie a placa .<ol><li>Usando uma pipeta multicanal, adicione 100 μL de tampão de bloqueio (5% NFDM em PBS) a cada poço revestido para bloquear locais de ligação inespecíficos.</li>
		<li>Cubra a placa com uma película de vedação.</li>
		<li>Incubar a placa durante 1 h a 37 °C numa câmara de humidade.</li>
		<li>Usando uma lavadora de microplacas, aspire a solução de revestimento e lave a placa três vezes com um tampão de lavagem (3 x 300 μL de PBST por poço).</li>
	</ol></li>
	<li>Preparar uma curva de calibração e controlo positivo (figura 2).<ol><li>Preparar a solução-padrão de trabalho do antigénio HER2 adicionando 2 μL de solução-mãe de 1 mg/ml a um μl de PBS a 1998 μL de PBS para obter uma concentração de HER2 de 0,001 mg/ml (1000 ng/ml).</li>
		<li>Diluir a solução-padrão de trabalho (WSS) adicionando 200 μl da solução a 1800 μl de PBS para obter a solução-padrão 1 (STD 1).</li>
		<li>Prepare seis padrões subsequentes (STD 2-STD 7) por diluições seriadas de STD 1 em PBS (Figura 2).<ol><li>STD 2: Adicione 500 μL de STD 1 a 500 μL de PBS e misture bem para preparar 50 ng/mL.</li>
			<li>STD 3: Adicione 500 μL de STD 2 a 500 μL de PBS e misture bem para preparar 25 ng/mL.</li>
			<li>STD 4: Adicione 500 μL de STD 3 a 500 μL de PBS e misture bem para preparar 12,5 ng/mL.</li>
			<li>STD 5: Adicione 500 μL de STD 4 a 500 μL de PBS e misture bem para preparar 6,25 ng/mL.</li>
			<li>STD 6: Adicione 500 μL de STD 5 a 500 μL de PBS e misture bem para preparar 3,125 ng/mL.</li>
			<li>STD 7: Adicione 500 μL de STD 6 a 500 μL de PBS e misture bem para preparar 1,5625 ng / mL.</li>
			<li>STD 8: Adicione 500 μL de PBS para preparar 0 ng/mL.</li>
		</ol></li>
		<li>Controle positivo: Diluir STD 1 adicionando 100 μL da solução STD 1 a 900 μL de PBS para obter uma solução de HER2 na concentração de proteína de 10 ng/mL.</li>
	</ol></li>
	<li>Prepare amostras para experimentos de pico e recuperação.<ol><li>Prepare as amostras de matriz (PBS, lisados celulares e meio de cultura) enriquecidas com a concentração conhecida da proteína HER2. Dilua os lisados celulares 1:2000 adicionando 2,5 μL de lisado celular apropriado a 5 mL de PBS para adquirir uma matriz de amostra com nível de HER2 abaixo do LOD do método.</li>
		<li>Use WSS (1000 ng/mL) e STD1 (100 ng/mL) para aumentar as amostras de matriz.</li>
		<li>Para cada matriz, prepare 6 amostras com concentrações de 0, 2, 5, 10, 30 e 50 ng/mL.</li>
		<li>Para preparar 0 ng/ml, adicionar 400 μL de PBS/meio de cultura/lisado celular.</li>
		<li>Para preparar 2 ng/ml, adicione 8 μL de STD1 a 392 μL de PBS/meio de cultura/lisado celular e misture bem.</li>
		<li>Para preparar 5 ng/ml, adicionar 20 μL de STD1 a 380 μL de PBS/meio de cultura/lisado celular e misturar bem.</li>
		<li>Para preparar 10 ng/ml, adicionar 4 μL de WSS a 396 μl de PBS/meio de cultura/lisado celular e misturar bem.</li>
		<li>Para preparar 30 ng/ml, adicionar 12 μL de WSS a 388 μL de PBS/meio de cultura/lisado celular e misturar bem.</li>
		<li>Para preparar 50 ng/mL, adicione 20 μL de WSS a 380 μL de PBS/meio de cultura/lisado celular e misture bem.</li>
	</ol></li>
	<li>Adicione a amostra, em branco e padrão.<ol><li>Usando uma pipeta de canal único, adicione 100 μL de padrões, branco (PBS) e amostras testadas (lisados celulares e meio de cultura) aos poços apropriados. NOTA: É aconselhável executar cada amostra em triplicado.</li>
		<li>Cubra a placa com uma película de vedação.</li>
		<li>Incubar a placa durante 1 h a 37 °C numa câmara de humidade.</li>
		<li>Usando uma lavadora de microplacas, aspire a solução de revestimento e lave a placa três vezes com um tampão de lavagem (3 x 300 μL de PBST por poço).</li>
	</ol></li>
	<li>Detecte a ligação de anticorpos.<ol><li>Diluir o anticorpo de detecção biotinilado (clone 70.21.73.67) em PBS até uma concentração de trabalho de 1 μg/ml. Para uma placa, use 6,5 mL de solução de trabalho de anticorpo de detecção.</li>
		<li>Usando uma pipeta multicanal, adicione 100 μL da solução de trabalho do anticorpo de detecção a cada poço.</li>
		<li>Cubra a placa com uma película de vedação.</li>
		<li>Incubar a placa durante 1 h a 37 °C numa câmara de humidade.</li>
		<li>Usando uma lavadora de microplacas, aspire a solução de revestimento e lave a placa três vezes com um tampão de lavagem (3 x 300 μL PBST por poço).</li>
	</ol></li>
	<li>Adicione o conjugado Avidin-HRP.<ol><li>Dilua o conjugado Avidin-HRP comercialmente disponível 1:40.000 adicionando 1 μL de conjugado enzimático a 40 mL de PBST.</li>
		<li>Usando uma pipeta multicanal, adicione 100 μL do conjugado diluído a cada poço.</li>
		<li>Cubra a placa com uma película de vedação.</li>
		<li>Incubar a placa durante 1 h a 37 °C numa câmara de humidade.</li>
		<li>Usando uma lavadora de microplacas, aspire a solução de revestimento e lave a placa três vezes com um tampão de lavagem (3 x 300 μL de PBST por poço).</li>
	</ol></li>
	<li>Reação colorimétrica<ol><li>Usando uma pipeta multicanal, adicione 100 μL de substrato de 3,3',5,5′-tetrametilbenzidina (TMB) a cada poço.</li>
		<li>Cubra a placa com uma película de vedação.</li>
		<li>Incube a placa por 1-5 min a 37 °C longe da luz e monitore o desenvolvimento da cor.</li>
		<li>Quando a cor atingir o nível esperado, adicione 100 μL de solução de parada para encerrar a reação. NOTA: O nível esperado corresponde a uma cor azul intensa em poços contendo amostras com alta concentração do analito.</li>
	</ol></li>
	<li>Adquira e analise dados.<ol><li>Medir a absorvância a 450 nm utilizando um leitor de microplacas.</li>
		<li>Usando uma curva de calibração de 4 paramétricas, calcule a concentração da amostra com base na equação da curva.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68204/68204fig1v5.jpg"> Figura 1: Diagrama esquemático do fluxo de trabalho ELISA sanduíche anti-HER2 desenvolvido. Visão geral das principais etapas do procedimento ELISA sanduíche. Isso inclui as etapas críticas (destacadas com uma moldura vermelha), como revestimento de placa com o anticorpo anti-HER2 de captura 70.27.58, a adição de amostras (padrões de curva, branco, amostras experimentais dos lisados celulares ou meio de cultura) e a ligação do anticorpo anti-HER2 de detecção 70.21.73.67. O ensaio termina com a detecção de sinal e análise de dados, onde o sinal colorimétrico é quantificado usando um leitor de microplacas para determinar a concentração do antígeno alvo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68204/68204fig1v5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68204/68204fig02.jpg"> Figura 2: Esquema que apresenta a preparação das soluções padrão da curva de calibração. Diluições seriadas da proteína recombinante HER2 são preparadas para gerar uma curva de calibração em uma faixa de concentração de 1,56-100 ng / mL (frascos STD 1-STD 7). Além disso, inclui-se a amostra de controlo negativo sem a proteína HER2 (STD 8). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68204/68204fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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</ol>

<table><tbody><tr><td>Kit de rotulagem de biotina-NH2</td><td>Abnova</td><td>KA0003</td><td></td></tr><tr><td>Grau de Blotting, leite em pó, baixo teor de gordura</td><td>Roth</td><td>T145.1</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de contagem de células para contador de células TC10/TC20, placas de</td> cultura de células <td>Bio-Rad</td><td>145-0011</td><td></td>de câmara dupla</tr><tr><td></td><td>Biologix</td><td>07-6012</td><td></td></tr><tr><td>Raspadores de células</td><td>Biologix</td><td>70-1250</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Ohaus</td><td>30130868</td><td></td></tr><tr><td>Gabinete de Segurança Biológica Classe II - Telstar Bio II Advance 6</td><td>Telstar</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Fundo Plano Transparente de 96 Poços</td><td></td> Incubadoras de CO2 <td>Thermo Fisher</td> 442404 <td></td></tr><tr><td>Culture - Touch 190S</td><td>Leec</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM - glicose alta</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D0822</td><td></td></tr><tr><td>Leitor de placas ELISA</td><td>BioTek</td><td>800TSUVI</td><td></td></tr><tr><td>FBS Standard, soro fetal bovino</td><td>PAN Biotech</td><td>P30-19375</td><td></td></tr><tr><td>Secador de laboratório de circulação forçada</td><td>BINDER</td><td>9090-0018</td><td></td></tr><tr><td>HRP-Avidin</td><td>Thermo Fisher</td><td>43-4423</td><td></td></tr><tr><td>Proteína humana Her2 / ErbB2, Fc Tag, grau premium</td><td>AcroBIOSYSTEMS</td><td>HER2-H5253</td><td></td></tr><tr><td>Immunowash Microplate Washer</td><td>Bio-Rad</td><td>170-7009</td><td></td></tr><tr><td>Solução de L-glutamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>mAb a-HER2 (clone 70.21.73.67)</td><td>SDS Optic</td><td>BIO-ABH-2</td><td></td></tr><tr><td>mAb a-HER2 (clone 70.27.58)</td><td>SDS Optic</td><td>BIO-ABH-1</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231 Linha celular</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>POCH</td><td>810530115</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>POCH</td><td>BA0981118</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de Protease Coquetel</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Buffer</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R0278</td><td></td></tr><tr><td>ROTI Fair PBS</td><td>Roth</td><td>1111.2</td><td></td></tr><tr><td>SK-BR-3 [SKBR3] Linha celular</td><td>ATCC</td><td>HTB-30</td><td></td></tr><tr><td>SK-OV-3 [SKOV-3; SKOV3] Linha celular</td><td>ATCC</td><td>HTB-77</td><td></td></tr><tr><td>Solução de parada 1x</td><td>Abcam</td><td>ab210900</td><td></td></tr><tr><td>TC20 Contador de células automatizado</td><td>Bio-rad</td><td>1450102</td><td></td></tr><tr><td>substrato TMB 1x</td><td>Abcam</td><td>ab210902</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Ohaus</td><td>30392117</td><td></td></tr><tr><td>agitador de movimento</td><td>Ohaus</td><td>30391968</td><td></td></tr></tbody></table>

ensaio imunoquímico validado para determinação abrangente do receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano liberado e ligado às células

Validated Immunochemical Assay for Comprehensive Determination of the Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 Released from and Bound to Cells

Validação ELISA sanduíche O ensaio recém-desenvolvido requer um procedimento de validação. Os parâmetros de validação importantes incluem linearidade, precisão e limites de detecção, ou seja, limite inferior de detecção (LLOD) e limite superior de detecção. No artigo anterior, realizamos uma validação completa do método. A linearidade do ELISA foi testada usando as amostras simuladas para concentrações baixas (2, 5, 10 ng/mL), médias-altas (30 ng/mL) e significativamente aumentadas (50 ng/mL) do antíg...

Ensaio imunoquímico validado para determinação abrangente do receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano liberado e ligado às células

Human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) is a well-established cancer marker. It became a very successful diagnostic and therapeutic target, ...

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Pesquisa sobre o Câncer

O ensaio de libertação de crómio, um ensaio comum para a detecção da actividade de células T citotóxicas, tem várias limitações. Usando células T CD8 específicos de antígenos ea linha de tumor de câncer de mama humano, SKBR3, no presente artigo, uma abordagem baseada em impedância foi examinado para a capacidade de detecção de morte celular.

Determinando a atividade citotóxica Optimal específicos de células CD8 Her2neu Humanos T, comparando a Cr51 Ensaio de Libertação do Sistema xCELLigence

Ao longo dos últimos anos, os ensaios baseados em células vivas têm sido utilizados com sucesso para detectar anticorpos contra antigénios de superfície e de conformação. Aqui, descrevemos um método que utiliza o fluxo de alto rendimento citometria permitindo a análise de grandes grupos de pacientes. Detecção de novos anticorpos irá melhorar o diagnóstico e tratamento de distúrbios mediados pela imunes.

High-throughput Citometria de Fluxo Ensaio Celular para detectar anticorpos em N-metil-D-aspartato ou dopamina-2 Receptor em Soro Humano

Este protocolo descreve a marcação do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) em células de fibroblastos COS7 e subsequente microscopia eletrônica e de luz correlativa de células inteiras em estado hidratado. O rótulo continha pontos quânticos fluorescentes. O protocolo pode ser usado para estudar a estequiometria do EGFR no nível de molécula única.

Estudando a estequiometria do Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico em células intactas utilizando Microscopia Correlativo

Descreve-se um bioensaio baseado em células simples para a detecção, quantificação e a monitorização da actividade de membros da família de ligandos vasculares factor de crescimento endotelial. O ensaio utiliza receptores quiméricos expressos numa linha celular dependente de factores para proporcionar uma avaliação semi-quantitativa ou quantitativa de ligação ao receptor e a reticulação pelo ligando.

A Bioensaio simples para a avaliação dos fatores de crescimento endotelial vascular

Isoeléctrica capilar é uma técnica baseada em anticorpos, ultra-sensível, alta taxa de transferência, permitindo a caracterização detalhada de proteínas e suas isoformas das amostras biológicas extremamente pequenas. A seguir descreve um protocolo para a detecção e quantificação de proteínas específicas e suas isoformas de forma automatizada e robotizada.

Detecção altamente sensível e quantitativa de proteínas e suas isoformas pelo método isoeléctrica capilar

Anticorpos que se ligam a receptores de alvo na superfície da pilha podem conferir alterações clusterização e conformação. Estas mudanças dinâmicas têm implicações para caracterizar o desenvolvimento de drogas em células-alvo. Este protocolo utiliza a microscopia confocal e espectroscopia de correlação de imagem através do ImageJ/FIJI para quantificar a extensão do receptor na superfície das células de clustering.

Microscopia confocal revela agregação de receptores de superfície celular através de espectroscopia de correlação de imagem

Aqui nós apresentamos um método de citometria de fluxo baseados em células para detectar anticorpos neutralizantes ou outros fatores que interferem com a absorção celular de terapias de substituição enzimática em uma matriz humana, tais como fluido espinal cerebral (CSF) ou soro humano.

Anticorpos que neutralizam a absorção celular de terapias de substituição enzimática com um ensaio de baseada em célula de

Descrevemos um sistema quantitativo de ensaio de citolíse in vitro em tempo real para avaliar a potência das células T do receptor de antígeno quimérico que visam células tumorais líquidas e sólidas. Este protocolo pode ser estendido para avaliar outras células efetores imunes, bem como tratamentos combinados.

Um ensaio de potência em tempo real para células T do receptor de antígeno quimérico visando células cancerosas sólidas e hematológicas

Um passo necessário no desenvolvimento do aptâmero anticâncer é testar sua ligação ao alvo. Demonstramos um ensaio baseado em citometria de fluxo para estudar essa ligação, enfatizando a importância de incluir um aptâmero de controle negativo e células cancerígenas que são positivas ou negativas para essa proteína em particular.

Um ensaio de ligação de proteínas de superfície celular baseado em citometria de fluxo para avaliar a seletividade e a especificidade de um Aptamer anticancerígeno

Aqui, apresentamos um protocolo para um ensaio de citotoxicidade mediada por células (ADCC) dependente de anticorpos usando um kit de bioensaio ADCC. Este método oferece uma ferramenta valiosa para elucidar o mecanismo ADCC e avaliar o potencial terapêutico dos anticorpos na imunoterapia contra o câncer.

Avaliação da citotoxicidade dependente de anticorpos e mediada por células em células cancerígenas usando bioensaio Reporter de citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos

Aprenda a realizar um ensaio ELISA sandwich validado para quantificação precisa do HER2 em células cultivadas e amostras de pacientes. Este método utiliza anticorpos monoclonais anti-HER2 para diagnóstico e pesquisa oncológica.

Ensaio imunoquímico validado para determinação abrangente do receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano liberado e ligado às células (Vídeo) | JoVE Journal

Ensaio imunoquímico validado para determinação abrangente do receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano liberado e ligado às células

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