Ensaio imunoquímico validado para determinação abrangente do receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano liberado e ligado às células

Apresentamos um sanduíche validado, ELISA, usando novos anticorpos monoclonais, que permite a quantificação precisa do domínio extracelular ligado e liberado da proteína HER2 para células cultivadas in vitro e amostras de pacientes.

O protocolo aborda a necessidade de um ensaio preciso e validado para correlacionar a concentração da proteína HER2 circulante com as manifestações clínicas da doença em diagnósticos e pesquisas.

A ampla gama de trabalho do ensaio, a variedade de tipos de amostras e a confiabilidade dos resultados podem abrir novas oportunidades para uma análise abrangente do status do receptor em modelos in vitro e in vivo.

O ELISA desenvolvido será usado para quantificação de HER2 liberado de tecidos cancerígenos em diferentes excreções do corpo humano, como sangue, fluidos peritoneais ou muco.

[Instrutor] Para começar, separe as células usando tripsina depois que atingirem 80% de confluência e colete-as em um tubo cônico separado de 15 mililitros. Depois de contar as células usando um contador automático de células e semear três vezes 10 elevado à potência de cinco células por poço em uma placa de 12 poços com um mililitro de meio de crescimento. Incube a cultura a 37 graus Celsius em uma atmosfera umidificada contendo 5% de dióxido de carbono. A partir da cultura de 24 horas, coletar o meio de cultura de um poço de cada linha celular em um tubo de 1,5 mililitro. Centrifugue as amostras coletadas a 10.000 g por 10 minutos a quatro graus Celsius e transfira o sobrenadante para um novo tubo para armazenamento a menos 20 graus Celsius. Lave as células restantes em cada poço com um mililitro de PBS frio, aspire suavemente e descarte o PBS. Em seguida, adicione 200 microlitros de tampão RIPA, suplementado com inibidor de protease a 1% em cada poço e incube por cinco minutos. Agora, raspe as células com um raspador de células e misture o lisado pipetando várias vezes para homogeneizar. Colete as células lisadas em um novo tubo e aspire lentamente a amostra para uma seringa de dois mililitros equipada com uma agulha de calibre 21 medindo 0,8 por 40 milímetros. Depois de aspirar cinco a 10 vezes, centrifugar as amostras coletadas a 10.000 G por 10 minutos a quatro graus Celsius e transferir o sobrenadante para um novo tubo para armazenamento a menos 20 graus Celsius. Diluir o anticorpo de captura Anti-HER2 para um micrograma por mililitro no tampão de codificação. Usando uma pipeta multicanal, adicione 100 microlitros da solução de anticorpos de captura a cada poço de uma placa ELISA de 96 poços. Cubra a placa com filme de vedação. Incube a placa durante a noite a quatro graus Celsius. Após a incubação durante a noite, coloque a placa em temperatura ambiente em um agitador de microplacas horizontal por uma hora. Usando uma lavadora de microplacas, aspire a solução de revestimento e lave cada poço três vezes com 300 microlitros de PBST. Em seguida, com uma pipeta multicanal, adicione 100 microlitros de tampão de bloqueio contendo 5% de leite em pó desnatado em PBS a cada poço revestido para bloquear locais de ligação não específicos. Agora, prepare a curva de calibração e o controle positivo. Adicione dois microlitros de um miligrama por mililitro, solução estoque de HER2 a 1.998 microlitros de PBS para criar um padrão de trabalho de 1000 nanogramas por mililitro. Para o padrão dois, adicione 500 microlitros do padrão um a 500 microlitros de PBS e misture bem para atingir a concentração de 50 nanogramas por mililitro. Prepare a diluição em série para gerar os padrões de três a sete. Em seguida, prepare amostras de matriz usando lisados de células PBS e meio de cultura enriquecido com concentrações conhecidas de HER2. Diluir lisados celulares de um a 2000 com 2,5 microlitros de lisado e cinco mililitros de PBS para obter níveis de HER2 abaixo do limite de detecção. Para preparar uma solução de dois nanogramas por mililitro, adicione oito microlitros de um padrão a 392 microlitros de meio de cultura PBS ou lisado celular e misture bem. Usando uma pipeta de canal único, adicione 100 microlitros de branco PBS padrão e teste as amostras em triplicata em seus respectivos poços da placa ELISA revestida e bloqueada. Após uma hora a 37 graus Celsius em uma câmara de umidade, lave a placa usando uma lavadora de microplacas. Para detectar a ligação de anticorpos, diluir o anticorpo de detecção biotinilado em PBS até uma concentração de trabalho de um micrograma por mililitro. Em seguida, usando uma pipeta multicanal, adicione 100 microlitros dessa solução de anticorpos de detecção a cada poço. Em seguida, diluir o conjugado AVID e HRP um a 40.000 em 40 mililitros de PBST. Usando uma pipeta multicanal, adicione 100 microlitros do conjugado diluído a cada poço. Depois de incubar e lavar a placa, use uma pipeta multicanal para adicionar 100 microlitros de substrato de 3,3 5,5 tetrametilbenzidina a cada poço para iniciar a reação métrica de cor. Em seguida, cubra a placa com uma película de vedação. Incube a placa a 37 graus Celsius por um a cinco minutos, protegendo-a da luz enquanto monitora o desenvolvimento da cor. Quando a intensidade de cor desejada for atingida, adicione 100 microlitros de solução de parada a cada poço para encerrar a reação. Finalmente, meça a absorbância em 450 nanômetros usando um leitor de microplacas. Usando uma curva de calibração de quatro parâmetros, calcule a concentração da amostra com base na equação da curva. O sanduíche desenvolvido, ELISA, demonstrou uma faixa de trabalho para a proteína HER2 de 1,56 a 100 nanogramas por mililitro, com um coeficiente de determinação de um indicando excelente correspondência. A concentração de HER2 no meio de cultura aumentou ao longo do tempo para todas as linhagens celulares testadas com os maiores valores em 72 horas. As células SK-OV-3 e SK-BR-3 apresentaram concentrações de HER2 aproximadamente dez vezes e 50 vezes maiores, respectivamente, em comparação com as células MDA-MB-231 no meio de cultura em 24 horas. Da mesma forma, os níveis de HER2 nos lisados foram cerca de três vezes e cinco vezes maiores para SK-OV-3 e SK-BR-3, respectivamente. Curiosamente, o meio de cultura celular continha concentrações 1000 vezes menores do antígeno testado em comparação com a proteína ligada à membrana encontrada em lisados de células inteiras.