Name: Geração de Culturas Monoclonais a partir de Wolbachia-infectada com Drosophila melanogaster JW18 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-27T13:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: Aprenda a gerar culturas monoclonais de células JW18 infectadas por Wolbachia em Drosophila melanogaster. Este protocolo de baixo custo minimiza estresse celular e reduz variabilidade experimental em estudos de simbiose.

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<table><tbody><tr><td>0,22 &micro; M Seringa Fliter&nbsp; &nbsp;</td><td>TPP</td><td>99722</td><td>Estéril</td></tr><tr><td>10x solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>70011044</td><td>Estéril</td></tr><tr><td>Cobertura de lamínula redonda de 12 ou 18 mm&nbsp;</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos Falcon de 15 mL</td><td>Genoplast</td><td>601052</td><td>Estéril</td></tr><tr><td>Placa de 24 poços</td><td>CytoOne</td><td>CC7682-7524</td><td>Cultura de tecidos tratada</td></tr><tr><td>5 &micro; Filtro de seringa M</td><td>O que homem</td><td>10462000</td><td>Estéril</td></tr><tr><td>Placa de 6 poços</td><td>CytoOne</td><td>CC7682-7506</td><td>Cultura de tecidos tratada</td></tr><tr><td>Placa de 96 poços</td><td>CytoOne</td><td>CC7682-7596</td><td>Cultura de tecidos tratada</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>J66501.30</td><td></td></tr><tr><td>Balão de cultura de células de 25 cm2</td><td>Greiner Bio-one</td><td>391-3103</td><td>Estéril</td></tr><tr><td>Raspadores de células&nbsp;</td><td>Greiner Bio-one</td><td>391-3010</td><td>Estéril</td></tr><tr><td>Esmalte transparente&nbsp;</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Frascos CryoPure</td><td>Sarstedt</td><td>72.379</td><td>Estéril</td></tr><tr><td>DMSO, grau de cultura celular</td><td>Merck</td><td>D2650-100ML</td><td>Estéril</td></tr><tr><td>DreamTaq PCR Master Mix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K1081</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Merck</td><td>324503-100GM</td><td>Estéril</td></tr><tr><td>Fonte de alimentação de eletroforese</td><td>Merck</td><td>PS 251-2</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp; Concentrador Plus</td><td>Merck</td><td>EP5305000509</td><td>Concentrador de vácuo de qualquer marca pode ser usado em seu lugar.&nbsp;</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck</td><td>1009861000</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de imagem EVOS M5000</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMF5000</td><td>Microscópio invertido de qualquer marca pode ser usado para monitorar a progressão do clone. O microscópio fluorescente é necessário para visualizar o FISH.&nbsp;</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>Merck</td><td>F9665</td><td>Inativado por calor</td></tr><tr><td>Formaldeído&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>047377.9L</td><td></td></tr><tr><td>Formamida&nbsp;</td><td>Merck</td><td>F7503-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Tanques de eletroforese em gel</td><td>Cutelo Científico</td><td>MSMIDI</td><td></td></tr><tr><td>Gerador de imagens em gel</td><td>BioRad</td><td>12009077</td><td>Sistema de imagem em gel GelDoc Go</td></tr><tr><td>GeneRuler 100 bp DNA Ladder</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>SM0243</td><td></td></tr><tr><td>Bloco de aquecimento</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>88870005</td><td></td></tr><tr><td>Gabinete de Segurança Biológica Herasafe 2025 Classe II</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51033314</td><td>O armário de segurança biológica de qualquer marca pode ser usado desde que mantenha o ambiente estéril no interior.</td></tr><tr><td>Solução Hoechst 33342 (20 mM) 5 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62249</td><td>Armazene no escuro.</td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>Merck</td><td>258148-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Integra Biosciences Corp&nbsp; PIPETBOY acu 2 Pipet Aid</td><td>Fisher Científico</td><td>NC0085686</td><td>Pode ser usado um controle de pipeta sorológica de qualquer marca.&nbsp;</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Merck</td><td>I9516-1L</td><td></td></tr><tr><td>Freezer de laboratório</td><td>&nbsp; Liebherr&nbsp;</td><td>LGUex 1500 MediLine</td><td>Qualquer freezer capaz de manter a temperatura constante é adequado.&nbsp;</td></tr><tr><td>Tanque de nitrogênio líquido</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>CY50985</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio</td><td>Merck</td><td>CLS294875X25-72EA</td><td></td></tr><tr><td>Água de grau molecular</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta multicanal</td><td>Eppendorf</td><td>3125000036</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Peqlab</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitômetro Neubauer</td><td>Merck</td><td>BR717810-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Parafilme&nbsp; Filme de vedação M</td><td>Merck</td><td>HS234526B-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora refrigerada a peltier</td><td>Memmert</td><td>IPP55plus</td><td>Alguma incubadora capaz de manter 25 constantes? C é adequado. Nenhum controle de CO2 é necessário para a linhagem celular JW18 ou seus clones.</td></tr><tr><td>Fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (25:24:1)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>327115000</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de pipetas</td><td>Eppendorf</td><td>EP2231300008</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de potássio</td><td>Merck</td><td>Pág. 1190-500G</td><td>Estéril</td></tr><tr><td>Quasar&nbsp; Sonda 16s rRNA FISH marcada com 670 pôr</td><td>Tecnologias de Biopesquisa</td><td></td><td>Sequências personalizadas das sondas podem ser encontradas na Tabela 1.&nbsp;</td></tr><tr><td>MicroCentrífuga Refrigerada</td><td>Contato Labnet</td><td>C2500-R</td><td></td></tr><tr><td>rpl32 primer para a frente 5'-CCGCTTCAAGGGACAGTATC-3'</td><td>Genômica da Eurofins</td><td></td><td>Feito sob medida com base na referência citada no artigo</td></tr><tr><td>rpl32 primer reverso 5'-CAATCTCCTTGCGCTTCTTG-3'</td><td>Genômica da Eurofins</td><td></td><td>Feito sob medida com base na referência citada no artigo</td></tr><tr><td>SDS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9823</td><td>Estéril</td></tr><tr><td>Pipetas sorológicas</td><td>Corning</td><td>357771</td><td></td></tr><tr><td>Escudos e Sang M3 Inseto Médio</td><td>Merck</td><td>S8398</td><td>Estéril</td></tr><tr><td>Tampão de Hibridização Stellaris RNA FISH&nbsp; &nbsp;</td><td>Tecnologias de Biopesquisa</td><td>SMF-HB1-10</td><td>Estéril</td></tr><tr><td>Tampão de Lavagem Stellaris RNA FISH A&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Tecnologias de Biopesquisa</td><td>SMF-WA1-60</td><td>Estéril</td></tr><tr><td>Buffer de Lavagem de Peixe RNA Stellaris B&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Tecnologias de Biopesquisa</td><td>SMF-WB1-20</td><td>Estéril</td></tr><tr><td>Reservatórios de Reagentes Estéreis&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>8094</td><td>Estéril</td></tr><tr><td>Tampão TAE</td><td>Merck</td><td>1061741000</td><td>1x&nbsp;</td></tr><tr><td>Buffer TE&nbsp;</td><td>Merck</td><td>93283</td><td>Estéril</td></tr><tr><td>Termociclador</td><td>Syngen Biotech</td><td>Termobloco 96</td><td>Termociclador de qualquer marca pode ser usado em seu lugar.&nbsp;</td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Merck</td><td>10708976001</td><td>Estéril</td></tr><tr><td>Congelador de temperatura ultra baixa</td><td>Corporação PHC&nbsp;</td><td>MDF-DU502VH-PE</td><td>Qualquer freezer de laboratório capaz de manter -80? C pode ser usado.</td></tr><tr><td>Meio de Montagem Vectashield&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Laboratórios de vetores</td><td>H-1000-10</td><td></td></tr><tr><td>wsp primer para a frente 5'-TGGTCCAATAAGTGATGAAGAAAC-3'</td><td>Genômica da Eurofins</td><td></td><td>Feito sob medida com base na referência citada no artigo</td></tr><tr><td>wsp primer reverso 5'-AAAAATTAAACGCTACTCCA-3'</td><td>Genômica da Eurofins</td><td></td><td>Feito sob medida com base na referência citada no artigo</td></tr></tbody></table>

geração de culturas monoclonais a partir de wolbachia-infectada com drosophila melanogaster jw18

Generation of Monoclonal Cultures from Wolbachia-infected Drosophila melanogaster JW18 Cell Line

Visualizamos o processo de estabelecimento de culturas monoclonais com microscopia de luz desde o dia de preparação da suspensão e plaqueamento unicelular (dia 0) até o estabelecimento de linhagens celulares contínuas (dia 45 ou 77, Figura 2). Os primeiros sinais de divisão celular foram observados no dia 3 (4 dias após o plaqueamento, pois o plaqueamento foi realizado no dia 0) quando já havia quatro células por poço (Figura 2). No dia 14, os clones cresceram como uma monocamada (JW18-B9, C7 e E5) ou uma esfera (JW18-G4), que foi interrompida durante a passagem. No dia 28, as diferenças no crescimento entre as linhagens celulares foram mais óbvias. A cultura JW18-C7 foi confluente no dia 45, enquanto as demais culturas clonais foram estabelecidas apenas no dia 77. Também visualizamos as quatro culturas diferentes 30 passagens pós-estabelecimento para capturar diferenças nas morfologias celulares (Figura 3).
Para determinar o status de infecção por Wolbachia das culturas monoclonais, realizamos PCR (Figura 4) e FISH (Figura 5). Observamos que todos, exceto um clone (JW18-C7), produziram uma banda para o gene wsp , indicativo de uma infecção por Wolbachia . FISH corroborou os resultados da PCR: os clones JW18-B9, JW18-E5 e JW18-G4 retiveram a infecção por Wolbachia , enquanto o clone JW18-C7 não apresentou Wolbachia. No geral, a partir de uma população mista de células JW18, fomos capazes de estabelecer quatro culturas clonais, três das quais mantiveram a infecção original por Wolbachia . Os dados brutos podem ser acessados no Figshare: https://figshare.com/s/15fde47ca7338f31dda9.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68207/68207fig1.jpg"> 
Figura 1: Fluxo de trabalho para geração de cultura monoclonal. (A) Diluições primárias e secundárias na placa de 96 poços. (B) Células individuais pós-diluição serial. (CE) Progressão na multiplicação de células e transferência de placas de 96 poços para 24 e 6 poços, respectivamente. F) Culturas contínuas em balões de 25 cm para cultura de2 células. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68207/68207fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68207/68207fig2.jpg"> 
Figura 2: Progressão das linhagens clonais JW18 de cultura unicelular para multicelular. Imagens de campo claro de linhas clonais do dia 0 (dia do plaqueamento) ao dia 77, quando todas as linhas foram estabelecidas com sucesso em um frasco de cultura de2 células de 25 cm. Barras de escala = 25 μm (dia 0), 50 μm (dia 3), 150 μm (dia 14), 300 μm (dias 28, 45, 77). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68207/68207fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68207/68207fig3.jpg"> 
Figura 3: Morfologia de linhagens clonais individuais de JW18. Imagens de campo claro de linhas clonais mostrando morfologias celulares na passagem 30 após o estabelecimento. Barras de escala = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68207/68207fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68207/68207fig4.jpg"> 
Figura 4: Status de Wolbachia de culturas clonais examinadas por PCR. PCR para Wolbachia na linhagem de células parentais JW18 e linhas clonais JW18-B9, JW18-C7, JW18-E5 e JW18-G4 na passagem 11 após o estabelecimento. A banda Wolbachiawsp confirma a presença de Wolbachia, enquanto a banda Drosophilarpl32 é uma PCR de controle de qualidade de DNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68207/68207fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68207/68207fig5.jpg"> 
Figura 5: Status de Wolbachia de culturas clonais examinadas por FISH. Linha de células parentais JW18 e clones JW18-B9, JW18-C7, JW18-E5, JW18-G4 visualizados por coloração FISH na passagem 13 após o estabelecimento. A Wolbachia é corada com a sonda 16s rRNA Stellaris FISH marcada com Quasar 670 em magenta, e os ácidos nucléicos são corados com Hoechst 33342 em ciano. Barras de escala = 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68207/68207fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tabela Suplementar S1: Sondas de oligonucleotídeos projetadas contra Wolbachia wMel 16S rDNA e sua comparação com as sondas publicadas por Schneider et al.42. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68207/Table%20S1.%20Stellaris%20probe%20set%20_16052025.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>

Geração de Culturas Monoclonais a partir de Wolbachia-infectada com Drosophila melanogaster JW18

Cell lines are widely used models in biological research. They are particularly useful in studies of intracellular bacteria that cannot be efficiently ...

generation-monoclonal-cultures-from-wolbachia-infected-drosophila

Research

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Biology

Biologia

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