Preparação de tecido intacto para análise microscópica da camada de células do endosperma em sementes de Arabidopsis em desenvolvimento e maduras

Um de nossos escopos de pesquisa é a ciência de sementes. Nosso objetivo é responder à questão de como o endosperma contribui para a germinação das sementes. Um ensaio in vitro denominado ensaio de inibição do crescimento de sementes revelou a importância fisiológica do endosperma na germinação das sementes. As sementes de Arabidopsis são bastante pequenas e a localização da camada celular do endosperma fica abaixo da testa, que são as células. É um desafio preparar amostras de endosperma sem fixação química. Análises anteriores da análise do endosperma utilizaram amostras quimicamente fixadas, de modo que não foram capazes de observar o movimento das proteínas do organismo. Nosso protocolo permite cinco imagens celulares da dinâmica das células do endosperma. Nosso protocolo pode ser realizado usando equipamentos laboratoriais padrão e permite uma visão mais profunda dos mecanismos de eventos e moléculas intercelulares e da função regular do endosperma.

[Narrador] Para começar, cultive plantas de Arabidopsis no solo ou lã de rocha até a fase de floração. Marque as flores totalmente abertas com fios coloridos para indicar zero dias após a floração. Selecione siliques de 12 a 16 dias após a floração para o próximo procedimento. Usando uma tesoura fina, corte as sílicas em desenvolvimento marcadas no pedicelo e colete-as em tubos de 1,5 mililitro. Prepare um papel de filtro úmido para dissecação para evitar a dessecação e coloque a amostra sob um microscópio estéreo. Usando duas pinças, uma com pontas grossas para segurar e outra com pontas afiadas para rasgar. Separe uma válvula do replum. Em seguida, usando a pinça com as pontas fechadas, pegue suavemente as sementes em desenvolvimento dos siliques para evitar danificá-las. Ao empregar uma agulha de injeção de calibre 27, crie uma cicatriz de aproximadamente 0,1 a 0,2 milímetros de tamanho na testa e no endosperma ao redor do embrião. Segure a semente com uma pinça sem esmagá-la e faça a cicatriz na junção dos cotilédones e do radical. Agora, empurre o embrião beliscando a semente com uma pinça, tomando cuidado para não esmagar o envelope da semente e mantendo sua forma redonda. Insira a agulha de injeção no envelope vazio da cicatriz e perfure-o de dentro para fora. Em seguida, mantenha a agulha no lugar e use uma pinça de ponta fechada para arranhar a superfície do Testa. Em seguida, corte um lado do envelope de sementes para permitir que ele se abra. Agora, usando uma pinça de ponta afiada, abra o envelope de sementes em uma folha. A amostra isolada agora deve ser uma folha de bicamada composta de endosperma e testa. Coloque as sementes secas de Arabidopsis em um tubo de 1,5 mililitro e adicione um mililitro de água bidestilada a ele. Mantenha as sementes embebidas por pelo menos 40 minutos em temperatura ambiente. Prepare um papel de filtro úmido no palco do microscópio estéreo para dissecação e, usando uma micropipeta de 1000 microlitros, transfira as sementes embebidas para o papel de filtro úmido. Agora coloque a amostra sob um microscópio estéreo. Usando uma agulha de injeção, faça uma cicatriz de aproximadamente 0,2 milímetros de tamanho na testa e no endosperma ao redor do embrião. Segure a semente com uma pinça sem esmagá-la e direcione a junção entre o cotilédone e o radical para a cicatriz. Agora empurre o embrião para fora depois de beliscar a semente com uma pinça. Evite esmagar o envelope de sementes vazio e preserve sua forma redonda. Usando uma agulha de injeção, corte os lados superior e inferior do envelope de sementes vazio para moldá-lo em uma forma cilíndrica. Em seguida, corte o envelope cilíndrico da semente ao longo de seu eixo central para dividi-lo em dois pedaços. Os resultados devem ser folhas de bicamada feitas de endosperma e testa. Coloque as amostras isoladas de endosperma como folhas em uma lâmina de vidro e monte-as na água. Por fim, coloque suavemente uma lamínula sobre a amostra, garantindo que a camada do endosperma esteja voltada para cima em direção à lamínula. Use esmalte ou graxa para selar as bordas da lamínula e evitar a dessecação antes de observar a amostra ao microscópio. Numerosas células do endosperma e suas estruturas intracelulares foram visualizadas com sucesso a partir de sementes colhidas aos 14 dias após o florescimento usando o protocolo de preparo estabelecido. Corpos fotográficos foram detectados dentro do núcleo das células do endosperma, expressando PHYB-GFP sob luz branca, confirmando sua presença e localização nuclear. As células do endosperma mostraram formação reversível de fotocorpo após exposição alternada à luz vermelha e vermelha, confirmando a fotoreversibilidade do PHYB e a atividade biológica até 4,5 horas após a dissecção. A imagem fluorescente de lapso de tempo de mitocôndrias em células intactas do endosperma após três horas de inibição da semente foi realizada e o movimento mitocondrial foi detectado. Motilidade mitocondrial mais dinâmica foi observada nas células do endosperma após um dia de inibição da semente, indicando atividade crescente ao longo do tempo.