Name: Transdução generalizada de neurônios neocorticais de camundongos por injeção subaracnóidea de AAV2 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-23T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Aprenda a técnica de injeção subaracnóidea de AAV2 para transdução generalizada de neurônios neocorticais em camundongos adultos. Este método amplia quatro vezes a área de infecção viral e preserva o tecido cerebral para registros eletrofisiológicos.

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<table><tbody><tr><td><forte>Equipamento</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 &micro; L Seringa à prova de gás modelo 1701 RN (5 uL 75 RN microsseringa Hamilton)</td><td>Companhia Hamilton</td><td>Parte/REF # 7634-01, Hamilton ou cat no. HAM7634-01, Merck</td><td></td></tr><tr><td>Agulha 33 G RN, ponta 3</td><td>Companhia Hamilton</td><td>Parte/REF # 7803-05, Hamilton</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio binocular</td><td>Nikon ou Micromed</td><td>Modelo MC-4 ZOOM</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal de varredura a laser baseado em Cerna</td><td>ThorLabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fonte de luz fria</td><td>RWD</td><td>Modelo 76312</td><td></td></tr><tr><td>Leica VT1000 S Micrótomo de lâmina vibratória</td><td>Leica Biosystems</td><td>76001-014</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de anestesia de baixo fluxo com kit inicial</td><td>Corporação Científica Kent</td><td>13-005-111 (Modelo SomnoSuite)</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Mecânica 0.1 - 2,5 &micro; L Eppendorf Research plus</td><td>Eppendorf</td><td>3123000012</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Mecânica 10 - 100 &micro; L Eppendorf Research plus</td><td>Eppendorf</td><td>3123000047</td><td></td></tr><tr><td>Ratos Shaver</td><td>RWD</td><td>Modelo CP-5200</td><td></td></tr><tr><td>Microbroca com brocas (0,5 mm, redonda)</td><td>RWD</td><td>78001, 78040</td><td></td></tr><tr><td>ou instrumento estereotáxico de Desctop Digitas, máscara da anestesia do rato, barras da orelha do rato (60 graus)</td><td>RWD</td><td>Modelos 68027, 68665, 68306</td><td></td></tr><tr><td>Compressor de ar</td><td>Bambi</td><td>BB8</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta manual de canal único 0,5-10 &micro; L</td><td>RAINN</td><td>17008649</td><td></td></tr><tr><td>Instrumento estereotáxico para pequenos animais</td><td>KOPF</td><td>Modelo 962</td><td></td></tr><tr><td>Injetor estereotáxico</td><td>Stoelting</td><td>10-000-004</td><td></td></tr><tr><td><forte>Instrumentos Cirúrgicos (Ferramentas)</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agulha dentária de 30 G (Ni-pro)</td><td>Biodent Co. Ltd.</td><td></td><td>Para cortar a dura-máter</td></tr><tr><td>Raspador ósseo</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>10075-16</td><td></td></tr><tr><td>Alicate de osso</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>16025-14</td><td>Para remover o osso craniano</td></tr><tr><td>Espátulas curvas</td><td>Fábrica de suprimentos médicos Mozhaisk</td><td></td><td>Para remover o cérebro da abóbada craniana</td></tr><tr><td>Broca dentária</td><td>DRENDEL + ZWEILING</td><td></td><td>Para craniotomia; Forma: cilindro em forma de pêra / extremidade redonda / redondo; Diâmetro da ponta: 0,55-0,8 mm de diâmetro</td></tr><tr><td>Porta-agulha (Halsey Micro Needle Holder)</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>12500-12</td><td></td></tr><tr><td>Sutura Cirúrgica de Polipropileno ou Sutura Cirúrgica Vicryl (5-0, absorvível)</td><td>Produtos Walter (Ethicon)</td><td>S139044 (W9442)</td><td></td></tr><tr><td>Cabo de bisturi (#3) com lâminas de bisturi (#11)</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>10003-12, 10011-00</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura (tesoura extra estreita)</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>14088-10</td><td>para cortar a pele</td></tr><tr><td>Tesoura (tesoura fina)</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>14094-11</td><td>para cortar a sutura</td></tr><tr><td>Sutura cirúrgica PROLENE (polipropileno)</td><td>A Ethicon (Johnson & Johnson)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinças (fórceps #5)</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Pinças (pinças de inox polido)</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>11210-20</td><td></td></tr><tr><td><forte>Descartáveis</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringa de insulina de 1 ml</td><td>SITEKMED</td><td></td><td>Para carregar óleo de vaselina em uma microsseringa, para administrar drogas</td></tr><tr><td>Placa de cultura celular</td><td>Ciência da Vida SPL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cotonetes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Óculos de cobertura</td><td>Fisher Científico</td><td>12-545E</td><td></td></tr><tr><td>Agulha de seringa de insulina (27 G)</td><td>SITEKMED</td><td></td><td>Para remover detritos de um orifício (craniotomia)</td></tr><tr><td>Toalhetes sem fiapos CLEANWIPER</td><td>NetLink</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio</td><td>Fisher Científico</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Toalhas de papel</td><td>Lusco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilme</td><td>Laboratório de estatísticas</td><td>STLPM996</td><td></td></tr><tr><td>Luvas cirúrgicas estéreis</td><td>Dermagrip</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtro de Seringa Estéril (0.2 &mu; m)</td><td>Corning</td><td>431229</td><td></td></tr><tr><td><forte>Drogas/Produtos Químicos (Reagentes)</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% de formalina tamponada ou 4% de paraformaldeído</td><td>Produtos Químicos Termocientíficos</td><td>J61899. AK</td><td></td></tr><tr><td>Solução alcoólica de iodo (5%))</td><td>Renovação</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pomada antibiótica Baneocin (bacitracina + neomicina)</td><td>Sandoz</td><td></td><td>Agente antibacteriano para uso externo</td></tr><tr><td>Aqua Polymount</td><td>Policiências</td><td>18606-20</td><td></td></tr><tr><td>Carbomer Eye Gel Vidisic (gel oftálmico)</td><td>BAUSCH+LOMB (Santen)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microesferas FluoSphere modificadas com carboxilato (vermelho)</td><td>Thermo Fisher Científico</td><td>F-8801</td><td></td></tr><tr><td>Dexametasona (4 mg/mL)</td><td>Ellara (KRKA)</td><td></td><td>Glicocorticóide sintético</td></tr><tr><td>H2O destilado</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol (70%)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flexoprofeno 2,5% (cetoprofeno)</td><td>VIC</td><td></td><td>Anti-inflamatórios não esteróides (AINEs)</td></tr><tr><td>Solução de glicose 5%</td><td>Solopharm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-coelho IgG (H + L) adsorvido cruzado, Alexa Fluor 546</td><td>Thermo Fisher Científico</td><td>A-11010</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Karizoo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>solução de lidocaína (2% / 4%)</td><td>Solopharm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soro de cabra normal (NGS)</td><td>Abcam</td><td>AB7481</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Eco-servis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-parvalbumina de coelho</td><td>Merck Millipore</td><td>AB15736</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonal recombinante anti-Calbindina de coelho</td><td>Abcam</td><td>AB108404</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina (NaCl a 0,9% em H2O)</td><td>Solopharm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tritão X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50-178-1844</td><td></td></tr><tr><td>Óleo de vaselina</td><td>Genel</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

transdução generalizada de neurônios neocorticais de camundongos por injeção subaracnóidea de aav2

Widespread Transduction of Mouse Neocortical Neurons by Subarachnoid Injection of AAV2

Em uma série piloto de experimentos, usamos o método tradicional de injeção intracortical para transduzir neurônios piramidais da camada cinco no neocórtex de camundongos por AAV2 carregando o gene da channelrodopsina rápida (oChIEF) fundido com a proteína fluorescente EGFP sob o promotor CaMKII. Consistente com o aspecto característico da AAV212, obtivemos uma área de infecção relativamente pequena, não excedendo 1 mm de largura (Figura 1A). No entanto, em a...

Transdução generalizada de neurônios neocorticais de camundongos por injeção subaracnóidea de AAV2

Recombinant adeno-associated viruses are a flexible and powerful tool for the delivery and expression of various genes of interest in many areas of ...

widespread-transduction-mouse-neocortical-neurons-subarachnoid

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Aqui apresentamos a injeção intracraniana de vetores de AAV para a rotulagem fluorescentes de neurônios e células gliais no córtex visual.

Injeção intracraniana da adeno-associado vetores virais

Fonte: Li, D., et al. Injeção intratecal direta de vírus adeno-associados recombinantes em camundongos adultos. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra o procedimento para a injeção intratecal de vírus adeno-associados (AAV) no líquido cefalorraquidiano (LCR) de um camundongo acordado, abrangendo a preparação da seringa, o alinhamento da coluna vertebral e a inserção precisa da agulha. Este método valida a entrega de genes direcionados, apoiando seu potencial para terapias do SNC.

Entrega intratecal de vírus em um modelo de camundongo para tratamento de doenças do sistema nervoso central

Vetores virais permitem a manipulação de genes alvo. Nós demonstramos um método para a expressão de genes condicionais ou ablação da medula espinhal de rato, utilizando a injecção estereotáxica de um vector viral no corno dorsal, um local proeminente de contacto sináptico entre os aferentes primários e os neurónios de somatossensorial no sistema nervoso central.

Injeção estereotáxica de um vetor viral para manipulação genética condicional no Cabo de Rato Spinal

Nos últimos 15 anos, os vetores derivados do adenovírus canino tipo 2 (CAV2) provaram sua eficiência na transdução de células in vitro e in vivo e são amplamente utilizados para vacinação e terapia gênica. Aqui, descrevemos um procedimento para construir, produzir e purificar vetores CAV2, dando origem a suspensões virais de alto título.

Produção e Purificação de Adenovírus não replicativa Canino Tipo 2 vectores derivados

Aqui demonstramos uma técnica para transdução neuronal generalizada por injeção intraventricular de vírus adeno-associado no cérebro de camundongo neonatal.  Este método fornece uma maneira rápida e fácil de obter a expressão vitalícia de transgenes entregues por vírus.

Injection Viral intracerebroventricular do Neonatal do rato do cérebro para a transdução neuronal persistente e generalizada

Este vídeo mostra o procedimento de craniotomia que permite imagens crônicas de neurônios no córtex retroesplenial de camundongos usando microscopia in vivo de dois fótons na linha transgênica Thy1-GFP. Essa abordagem é combinada com a injeção de vírus adeno-associado que expressa mCherry no hipocampo dorsal. Essas técnicas permitem o monitoramento de longo prazo da plasticidade estrutural dependente da experiência em RSC.

Simultânea de dois fótons<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagem de Synaptic Entradas e metas pós-sinápticos no córtex do rato retrosplï¿½ico

O objetivo do presente estudo foi desenvolver e validar a potência e a segurança da entrega de genes mediada pelo vírus adeno-associado à coluna vertebral (AAV9) usando uma nova técnica de entrega de genes subpial em camundongos adultos.

Vedação subjugada Adeno-associada do vírus 9 (AAV9) em ratos adultos

Intraspinal injeção de recombinase dependente recombinante vírus adeno-associado (rAAV) pode ser usada para manipular qualquer tipo de célula geneticamente rotulados na medula espinhal. Aqui descrevemos como transduce neurônios no Corno dorsal da medula espinhal lombar. Esta técnica permite interrogatório funcional do subtipo neurônio manipulado.

Expressão do Transgene de mediada por vírus adeno-associado em geneticamente definidos neurônios da medula espinhal

Aqui apresentamos uma técnica de injeção intratecal direto usando cloridrato de lidocaína a 1% em uma solução viral para assegurar a entrega eficiente de vírus adeno-associado aos pequenos animais e estabelecer um sistema de Pontuação para prever a eficiência de transdução no central sistema nervoso de acordo com o grau de fraqueza transitória induzida pela lidocaína.

Injeção intratecal de vírus Adeno-associado recombinantes em ratos adultos

Este protocolo demonstra um novo método para a aplicação de terapias genéticas a subpopulações de células em ratos neonatais em idades pós-natais de 5 a 10 dias, injetando um modificador quimiogenético anterógrado no córtex somatomotor e uma Cre recombinase retrógrada transportável na medula espinhal cervical.

Visando o trato corticoespinhal em ratos neonatais com um vetor duplo-viral usando cirurgia combinada de cérebro e coluna vertebral

Este protocolo descreve a expressão ectópica mediada por vírus de Neurod1 após acidente vascular cerebral isquêmico cortical. O Neurod1 é administrado (1) usando o sistema Cre-Flex AAV em camundongos do tipo selvagem durante a fase subaguda pós-AVC (7 dias) e (2) usando um único vetor AAV em camundongos repórteres condicionais durante a fase crônica pós-AVC (21 dias).

Sistemas AAV e modelos de camundongos para investigar a expressão ectópica de Neurod1 em células transduzidas em tempos subagudos e crônicos pós-AVC isquêmico

Aprenda a técnica de injeção subaracnóidea de AAV2 para transdução generalizada de neurônios neocorticais em camundongos adultos. Este método amplia quatro vezes a área de infecção viral e preserva o tecido cerebral para registros eletrofisiológicos.

Transdução generalizada de neurônios neocorticais de camundongos por injeção subaracnóidea de AAV2

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