Transdução generalizada de neurônios neocorticais de camundongos por injeção subaracnóidea de AAV2

Nossa pesquisa está focada no desenvolvimento do método que permite a transdução viral de grande volume de tecido neural no neocórtex de camundongos. Normalmente, a suspensão de partículas virais é injetada diretamente no parênquima cerebral. Aqui, a transfecção da área é determinada pela difusão das partículas virais no tecido cerebral, que têm um alcance limitado.

Injetamos vírus vetores virais AAV2 no espaço subaracnóideo através da superfície do cérebro. Descobrimos que a administração subaracnóidea do vírus levou a um aumento de quase quatro vezes na área de infecção em comparação com a injeção intraparenquimatosa. A nova técnica fornece transdução generalizada de neurônios neocorticais em camundongos adultos e ajuda a preservar o tecido cerebral para registros ópticos ou eletrofisiológicos subsequentes da atividade neuronal.

Nosso método de injeção permite a expressão seletiva do transgene em uma grande camada populacional de cinco neurônios piramidais, mesmo quando se usa um forte promotor não seletivo. No entanto, o mecanismo de tal seletividade não é totalmente compreendido. Para começar, prenda os dentes da frente de um camundongo anestesiado na barra de dentes e monte a máscara do animal.

Posicione cuidadosamente o mouse nas barras auriculares. Raspe a cabeça dos olhos para trás das orelhas e, em seguida, limpe a superfície raspada com etanol a 70%, seguido de uma solução de iodo a 5% de álcool. Aplique solução estéril de lidocaína a 4% topicamente e injete 0,02 mililitros de dexametasona por via subcutânea para reduzir a dor e a inflamação.

Com um bisturi estéril e uma tesoura, faça uma incisão na linha média de quatro a cinco milímetros, começando entre as orelhas para abrir o couro cabeludo. Expanda a incisão usando uma tesoura para evitar danos ao crânio. Limpe a superfície do crânio com peróxido de hidrogênio a 3% para visualizar bregma e lambda.

Pare imediatamente a reação com solução salina de cloreto de sódio a 0,9%. Em seguida, use um raspador ósseo para remover o tecido da superfície do crânio. Monte o injetor motorizado pré-preparado com uma seringa Hamilton no braço estereotáxico.

Ilumine o crânio exposto usando uma fonte de luz cirúrgica e focalize o microscópio no bregma. Olhando através do microscópio, manipule o braço estereotáxico para alinhar a ponta da agulha diretamente sobre o bregma. Alinhe bregma e lambda horizontalmente usando a ponta da agulha.

Retorne ao bregma e registre as coordenadas. Mova a agulha para as coordenadas calculadas. Abaixe-o para a nova posição e marque-o.

Selecione o local para injeção viral próximo ao alvo, considerando a disseminação viral. Agora, use uma broca dentária estéril de 0,5 a 0,8 milímetros de diâmetro para criar uma pequena craniotomia enquanto visualiza através do microscópio. Use ar pressurizado para soprar a poeira óssea.

Banhe o buraco com soro fisiológico estéril e remova o excesso com um cotonete. Em seguida, use uma agulha de calibre 27 com ponta em forma de gancho ou pinça fina para remover o osso restante, tomando cuidado para não danificar a dura-máter. Cubra o crânio com uma toalha de papel umedecida com solução salina estéril.

Em seguida, coloque um filme transparente estéril sobre a superfície do crânio. Mova o braço estereotáxico para trás e alinhe a agulha da microseringa acima do filme transparente. Em seguida, dispense o excesso de óleo até que restem dois microlitros.

Pipete o volume de injeção viral e outros dois microlitros de vírus no filme transparente. Olhando pelo microscópio, abaixe a ponta da agulha no centro da gota do vírus. Agora carregue o vírus na micro seringa com um injetor motorizado.

Remova o papel umedecido do crânio e seque a área com um cotonete. Reposicione o braço estereotáxico e a agulha acima do local de inserção. Em seguida, dispense uma gota de vírus para verificar se há entupimento da agulha.

Faça um pequeno corte na dura-máter usando uma agulha de calibre 30 com uma ponta em forma de gancho. Abaixe a agulha da seringa até a dura-máter e calcule a profundidade de inserção com base no ponto de contato da superfície. Insira a agulha lentamente no córtex a uma profundidade de 300 micrômetros, aguarde dois a três minutos, retraia para 200 micrômetros e aguarde mais dois a três minutos.

Comece a injeção viral a 0,06 microlitros por minuto para um total de um microlitro. Após a infusão, mantenha a agulha no local alvo por 10 minutos para permitir a dispersão do vírus. Em seguida, retraia a agulha lentamente para evitar o refluxo.

Dispense uma gota de vírus para confirmar que a agulha não está entupida. Feche a incisão no couro cabeludo com suturas absorvíveis ou não absorvíveis 5-0. A administração subaracnóidea de um AAV2 levou a uma área significativamente maior de infecção neuronal em comparação com a injeção intracortical tradicional, com expansão de quase quatro vezes nas direções mediolateral e rostrocaudal.

A injeção do vírus subaracnóideo resultou em forte marcação fluorescente verde de neurônios nas camadas corticais dois, três e cinco, enquanto as camadas quatro e seis não mostraram corpos celulares marcados, mas exibiram dendritos e axônios visíveis, respectivamente. Partículas fluorescentes que foram adicionadas à suspensão do vírus injetado durante a injeção subaracnóidea foram encontradas ao longo da superfície do cérebro, indicando a disseminação do vírus através do líquido cefalorraquidiano, com cobertura de superfície mais ampla do que a marcação neuronal. A grande distribuição superficial de fluorescência verde nas seções frontais confirmou infecção cortical generalizada após injeção subaracnoide, em contraste com a pequena infecção localizada observada com a injeção padrão.

Nas camadas supergranulares, uma fração substancial de neurônios transduzidos co-expressou parvalbumina ou calbindina, enquanto nenhum interneurônio co-marcado foi detectado na camada cinco, e todas as células infectadas foram representadas exclusivamente por neurônios piramidais.