Fluxo de trabalho usando um microscópio de fluorescência coincidente criogênica, elétron e feixe de íons para moagem direcionada de células

Minha pesquisa desenvolve métodos de microscopia óptica para preservar características celulares em lamelas criogênicas durante a moagem por feixe de íons focados, permitindo análises detalhadas por tomografia eletrônica criogênica para descobrir a organização biológica nativa. A microscopia óptica foi integrada aos sistemas CrioFIB-SEM, mas raramente na mesma posição que a FIB. Isso exige abordagens de orientação baseadas em registro para preservar alvos marcados fluorescentemente na lamela final.

Para começar, resfrie manualmente a estação de transferência usando nitrogênio líquido assim que o estágio atingir temperaturas criogênicas. Carregue uma autograde clipada na cassete de amostra projetada para o sistema de microscopia criogênica. Certifique-se de que a autograde esteja posicionada entre o deslizante da tampa colada e o espaçador.

Aperte o parafuso do anel para fechar a fita cassete e insira-a na ranhura da estação de transferência. Conecte a estação de transferência ao sistema de microscopia criogênica. Use a câmera da câmara interna para guiar a fita cassete de amostra até o palco de amostra.

No software de microscopia óptica, mova o estágio da amostra da posição de carga para a posição pré-definida de três feixes. No software FIB-SEM, ajuste a ampliação para 100X e clique na janela superior esquerda. Na aba de alinhamento do software de microscopia de luz, clique no Z e selecione a função Play para adquirir um atlas SEM da grade.

Identifique uma área quadrada com filme de carbono quebrado e clique duas vezes nela para mover a etapa da amostra para esse local. Volte para a interface do software. Ative a FIB e adquira uma imagem.

Ajuste a ampliação usando o menu suspenso no canto superior esquerdo. Pressione Play para exibir a imagem da FIB. Depois, defina o tamanho do passo usando a barra deslizante.

Agora clique em Z e Z para ajustar a posição do estágio Z até que a linha horizontal presente no íon e as imagens de elétrons estejam alinhadas com a mesma característica. Selecione a aba SEM no software de microscopia óptica. Use os botões X e Y para alinhar uma característica comum entre as imagens SEM e iônicas.

Agora ligue o microscópio de fluorescência. Selecione a aba FLM, defina as condições de imagem por luz refletida e selecione Reproduzir. Depois, alinhe a imagem da luz refletida com a imagem do SEM.

Dê zoom na imagem e clique na opção retangular para definir um padrão de fresagem para o feixe de íons. Pressione Start Patterning na Tela 2 para fresar um pequeno padrão usando o feixe de íons focado. Confirme que o padrão fresado é visível tanto no feixe de íons focado quanto nas imagens do microscópio fluorescente.

No software de microscopia óptica, vá para a aba Localização e ative as condições apropriadas para configurar os canais fluorescentes. Atribua cada fluoróforo a um canal separado e inclua um canal adicional para campo claro. Ajuste a potência do LED e o tempo de exposição de cada canal fluorescente para identificar o alvo de interesse.

Quando os parâmetros estiverem satisfatórios, adquira uma pilha z fluorescente pré-fresada seguindo a direção axial. Depois, marque o alvo como uma região de interesse. Mude para o software FIB-SEM e desenhe uma lamela na região de interesse.

Realize fresagem bruta para remover o material em massa enquanto mantém o microscópio de fluorescência ligado para monitorar as mudanças de sinal. Abra o kit de ferramentas interferométricas baseado em Python a partir do terminal para monitorar o sinal fluorescente durante o afinamento das lamelas. Reduza o ROI para aproximadamente dois micrômetros usando o modo de seção transversal de limpeza.

Para um alvo com extensão axial superior a 300 nanômetros, na interface gráfica do Python selecione o alvo na micrografia de fluorescência. O software começará automaticamente a plotar o brilho em função do tempo a cada novo quadro. Monitore a intensidade da fluorescência através do kit de ferramentas Python.

Mouse a amostra usando o modo de seção transversal de limpeza para remover qualquer filme de suporte restante abaixo da região de interesse. Observe quedas súbitas na intensidade da fluorescência como sinais para mudar a direção de fresagem. Se uma diminuição acentuada for observada ao fresar de baixo para cima, pare e comece a fresar de cima para baixo.

Após concluir a fresagem de cima para baixo, finalize a lamela fresando de baixo para cima em modo de seção transversal de limpeza até atingir a espessura desejada. Depois, capture uma imagem de fluorescência pós-moagem da lamela. Transfira a amostra para um CryoTEM.

Carregue a imagem de fluorescência multicanal pós-fresagem e a imagem de projeção CryoTEM no software personalizado de transformação projetiva para registro de regiões de interesse. Agora selecione de oito a dez pares de pontos de referência que sejam visíveis tanto em imagens de fluorescência quanto de microscopia eletrônica para calcular a transformação projetiva. Use a imagem sobreposta como guia para selecionar uma área de imagem.

Depois, selecione os parâmetros de ampliação e aquisição apropriados para a série de inclinação, dependendo do tamanho da estrutura alvo e da resolução desejada. Células de macrófagos diferenciadas marcadas com SiR-Tubulina apresentavam um único ponto fluorescente brilhante, de aproximadamente um micrômetro de diâmetro, correspondente ao MTOC, junto com estruturas semelhantes à fibro irradiando em direção à periferia celular, consistentes com a rede de microtúbulos. À medida que a amostra era moída para aproximadamente 800 nanômetros de espessura, o ponto fluorescente único do MTOC se resolvia em dois pontos distintos, cada um com aproximadamente 700 nanômetros de diâmetro.

A intensidade da fluorescência aumentou após a remoção do material a granel não fluorescente e do filme de suporte absorvente, seguida por uma diminuição acentuada à medida que a lamela era ainda mais afinada de dois micrômetros para abaixo de 200 nanômetros. A fluorescência criogênica correlacionada e a microscopia eletrônica permitiram direcionamento preciso das estruturas durante a moagem. Tomogramas reconstruídos e modelos segmentados revelam que os centriolos são compostos por tercinos de microtúbulos.

Nos casos em que apenas uma mancha fluorescente foi mantida na lamela final, um único centriolo foi visualizado no tomograma correspondente. A precisão da fluorescência baseada no millimilling é limitada por abordagens de registro, que sofrem muito com resolução limitada por difração, descompasso do índice de refração e também movimento induzido pelo fresagem. Microscopia óptica simultânea e fresagem FIB removem erros de registro ao usar, em vez disso, o feedback em tempo real da microscopia de fluorescência para guiar o processo de fresagem.

Isso evita erros devido ao limite de difração e ao descompasso no índice de refração, permitindo uma fresagem precisa que preserva estruturas marcadas fluorescentes para crioelétrona dentro da lamela final. Nossa pesquisa possibilita ver estruturas celulares que antes eram difíceis de visualizar diretamente por crioET, lançando luz sobre os mecanismos moleculares por trás de um amplo espectro de máquinas micromoleculares chave.