Síntese de Vesículas Unilamelares Gigantes Compostas: Um Modelo Biomimético de Células Nucleadas

Este artigo apresenta um método para a preparação de vesículas unilamelares gigantes compostas (cGUVs) com uma estrutura vesícula em vesícula, com condutividade elétrica personalizada nas regiões interna, anular e externa. A eletroformação sintetiza GUVs simples, que são transformados em estomatócios e cGUVs por meio de choque osmótico, fornecendo um modelo valioso para estudar a biofísica de células nucleadas.

Conduzimos um estudo elaborado sobre a síntese e eletro-hidrodinâmica de vesículas unilamelares gigantes compostas para estabelecê-las como equivalentes biomagnéticos de células eucarióticas. A tentativa é entender as tecnologias que envolvem a aplicação de campo elétrico a células biológicas, como eletroporação celular e eletrodeformação celular.

Uma combinação de microscopia de fluorescência e luz, tratamentos elétricos de pulso de nanossegundos, osciloscópio e fontes de energia e métodos de síntese inovadores são empregados para avançar a pesquisa nesta área. O desafio na síntese de GUVs compostos bem formados é a sensibilidade de um método a uma temperatura, tipos de lipídios e a composição utilizada. Neste trabalho, demonstramos isso para um sistema DMPC e colesterol, mas generalizá-lo continua sendo um desafio. GUVs simples que mimetizam células nucléicas foram sintetizadas na literatura. Sintetizamos a vesícula gigante composta para emular células nucleadas com a estrutura de defesa da válvula, envolvendo uma vesícula interna de aproximadamente metade do tamanho da vesícula externa.

Vamos nos concentrar em estudar o efeito de pulsos de micro e nanossegundos na vesícula interna, que é uma imitação do núcleo de uma célula biológica no contexto da eletroporação.

[Narrador] Para começar, limpe completamente as lâminas de óxido de índio e estanho ou revestidas com ITO usando uma solução de detergente e enxágue com água deionizada com uma condutividade de 0,055 microsiemens por centímetro. Em seguida, usando uma solução de etanol 100%, limpe as lâminas novamente e enxágue com água deionizada. Seque as lâminas em um forno ajustado para 85 graus Celsius. Identifique o lado condutor de cada lâmina revestida com ITO usando um alicate amperímetro. Prenda a corrediça limpa no codificador de rotação stage usando um vácuo, garantindo que o lado condutor esteja voltado para cima. Aplique 25 microlitros da solução lipídica, uma é quatro gotículas no lado condutor de uma lâmina ITO. Pegue outra lâmina e aplique 25 microlitros da solução lipídica dois da mesma maneira. Seque a vácuo ambas as lâminas revestidas de lipídios em um dessecador armazenado no escuro por no mínimo duas horas. Em seguida, organize uma lâmina ITO revestida com lipídios em paralelo com uma lâmina limpa, garantindo que os lados condutores fiquem voltados um para o outro e coloque um espaçador de borracha de silicone de três milímetros de espessura entre eles. Sele a configuração com um grampo para criar uma câmara de eletroformação. Agora encha a câmara com solução de sacarose 100 milimolares usando uma seringa de dois mililitros. Conecte o cabo de saída do gerador de funções às corrediças revestidas com ITO com o gerador de funções. Coloque ambas as câmaras de eletroformação em uma incubadora mantida entre 38 e 40 graus Celsius. Aplique um campo elétrico de corrente alternada de cinco volts pico a pico na frequência de 10 hertz usando um gerador de função de canal duplo por quatro horas. Após a incubação, desconecte as câmaras de eletroformação do gerador de função. Retire-os da incubadora e deixe-os esfriar até a temperatura ambiente. Usando uma seringa, colha as vesículas unilamelares gigantes sintetizadas de cada câmara e transfira-as para tubos de microcentrífuga separados de dois mililitros. Incube os tubos em temperatura ambiente entre 25 e 27 graus Celsius por uma hora antes de proceder ao choque osmótico. Transfira 200 microlitros de vesículas unilamelares gigantes simples, ou sGUVs, suspensas em meio hidratante contendo solução de sacarose 100 milimolares para a câmara de observação e introduza 125 microlitros de solução de glicose 300 milimolares para induzir choque osmótico e iniciar transições de forma. Deixar repousar os sGUV, agora submetidos a choque osmótico, durante uma hora na câmara de observação colocada na fase de microscopia. Realizar microscopia de contraste de interferência diferencial e epifluorescência usando um microscópio invertido equipado com uma câmera monocromática. Use lentes objetivas de distância de trabalho extralonga Plan Fluor de 20X por 0,45 e 40X por 0,60 para observar as transições de forma nos sGUVs. Para epifluorescência, use um conjunto de filtros verdes com excitação de 510 a 560 nanômetros, um espelho dicróico de 575 nanômetros e um filtro de barreira de 590 nanômetros para bicamadas coradas de Niall Red. Monitore as transições de forma dentro da câmara de observação usando contraste de interferência diferencial e microscopia de epifluorescência com lentes objetivas Plan Fluor. Observe a formação de vesículas estomatocíticas à medida que a transição de forma prossegue. Monitore como as vesículas maiores se acomodam primeiro, seguidas por um aumento no número de vesículas menores ao longo do tempo. Em seguida, adicione solução salina para ajustar a condutividade em diferentes regiões dos cGUVs antes de induzir o choque osmótico. Por exemplo, para criar maior condutividade nas regiões externa e interna do que na região anular, transfira 200 microlitros de solução de sacarose para a câmara de eletrofusão. Adicione 20 microlitros de solução salina a 7,5 milimolares na câmara e induza o choque osmótico com 125 microlitros de solução de glicose a 300 milimolares. Deixe os sGUVs de choque osmótico repousarem na câmara por três a quatro horas. Confirme se os cGUVs resultantes têm maior condutividade nas regiões externa e interna em comparação com a região anular. Para realizar a eletrodeformação dos cGUVs, espaçe os eletrodos de fio a 500 micrômetros e aplique um potencial elétrico de corrente alternada de 7,5 volts pico a pico a 100 quilohertz usando um gerador de função. Depois que o campo elétrico for aplicado, capture o vídeo a 10 quadros por segundo e observe a deformação oblato das vesículas externas e a deformação prolata das vesículas internas. Em seguida, carregue a mistura cGUV em uma lâmina de cavidade e sele com uma lamínula para evitar movimento. Use um microscópio confocal de varredura a laser para analisar a morfologia do cGUV por meio da varredura do eixo Z com um tamanho de passo de um micrômetro. Empregue uma lente objetiva Plan Apochromat 40X por 1.3 óleo DIC para imagens. Use um modo vermelho de canal único com excitação de 561 nanômetros e emissão de 561 a 695 nanômetros para obter imagens de cGUV coradas com Niall Red ou Rhodamine PE. Modifique e extraia o arquivo . Arquivo de imagem CZI usando o software vinculado ao microscópio. Insira gráficos como barras de escala e habilite visualizações 2D e 3D. Em seguida, vá para o método de processamento e parâmetros para ajustar as configurações desejadas. Em seguida, clique em Aplicar para exportar a imagem no formato JPG. Por fim, abra o arquivo no software ImageJ. Para inserir uma barra de escala, vá para analisar, seguido de definir escala para calibrar e, em seguida, selecione analisar seguido por ferramentas e barra de escala para aplicá-la. A imagem confocal da pilha Z confirmou que as vesículas internas estavam totalmente separadas das vesículas externas e elevadas no plano Z devido à menor densidade da solução interna. O estado intermediário dos estomatócitos mostrou um colo estreito conectando as vesículas interna e externa antes da separação completa. Uma população diversificada de formas vesiculares, incluindo múltiplas vesículas internas, corpos em forma de estrela e estruturas tubulares foi observada seis horas após o choque osmótico. Uma alta abundância de cGUVs foi formada usando uma mistura lipídica de 1,2-Dimiristoíl-sn-glicero-3-fosfocolina e colesterol em uma proporção molar de 63 para 37. Sob um campo elétrico de corrente alternada, os cGUVs mostraram deformação com a vesícula externa formando uma forma oblato e a vesícula interna formando uma forma prolata.