Modelo de camundongo de doença hepática esteatótica associada à disfunção metabólica com fibrose

Em nossa pesquisa, focamos na doença hepática esteatótica associada a disfunção metabólica, ou MASLD, e especificamente nos mecanismos de acúmulo e fibrose lipídica. Alguns dos desenvolvimentos recentes são a transcrição de célula única e especial, a padronização de modelos animais de MASLD e a aprovação de semaglutida para o tratamento de MASLD. Existem muitos modelos animais de MASLD, mas descobrimos que muitos não induziram fibrose hepática.

Então, para abordar esse ponto, desenvolvemos nosso modelo de camundongo do MASLD. Nosso modelo camundongo induz MASLD com fibrose ao alimentar camundongos hiperfágicos com uma dieta semelhante à média americana. Isso causa MASLD, que é muito semelhante à doença em humanos.

Nosso método facilitará estudos sobre a fisiopatologia da MASLD e o teste de novas terapias. Para começar, obtenha uma seção de tecido hepático embutida em parafina em uma lâmina. Para a desparafinização, submerga a lâmina em xileno ou citrisolv por cinco a quinze minutos.

Depois, reidrate a seção em série em 100, 95 e 70% de etanol, seguido por água destilada por cinco minutos em cada um. Depois, tinga a seção com Sirius Red e desidrate o slide. Remova uma lâmina de cada vez da solução transparente e passe com papel toalha para remover o excesso de líquido.

Adicione aproximadamente de 50 a 100 microlitros de meio de montagem à seção. Cubra a seção com uma lâmina de cobertura e pressione suavemente para remover as bolhas de ar. Deixe o slide secar ao ar.

Agora, observe a seção preparada sob um microscópio óptico com iluminação em campo claro usando alvos de 4x a 20x. Transfira aproximadamente de 500 a 1000 microlitros de homogeneado hepático para tubos centrífugas de 1,5 mililitro e adicione ácido tricloroacético para atingir uma concentração final de 12%. Vórtice brevemente o tubo para misturar o conteúdo. Incube o tubo em banho-maria com gelo por 30 minutos e centrifuge-o a 6.000 g a quatro graus Celsius por 10 minutos.

Depois, remova o sobrenadante com uma pipeta. Adicione um mililitro de etanol 100% gelado para lavar o pellet e faça sonicação para resuspender completamente. Após centrifugar a suspensão novamente, aspire o sobrenadante.

Após a terceira lavagem, mantenha o tubo aberto para secar o pellet ao ar por 10 minutos ou mais, conforme necessário. Depois, adicione 800 micrólitros de 6 ácidos clorídricos normais ao tubo contendo a bolinha de proteína e ressuspenda a pelota usando um sonicador, como demonstrado anteriormente. Transfira a suspensão para um tubo de vidro com tampa roscada ou frasco e fele firmemente a tampo.

Incube o tubo no forno a 110 graus Celsius por cerca de 22 horas. Se necessário, transfira o conteúdo do frasco de vidro para um tubo centrífugo antes de girar. Centrifuge a amostra hidrolisada a 16.000 g por 10 minutos e aspire o sobrenadante contendo hidroxiprolina em um tubo de 1,5 mililitro.

Para oxidação de hidroxiprolina, adicione 450 microlitros de solução de cloramina a tubos com 50 microlitros de amostra e padrões. Misture o conteúdo dos tubos com um vórtice e incube-os em temperatura ambiente por 25 minutos. Depois, adicione 500 microlitros do reagente de Ehrlich a cada amostra e padrão.

Após o vórtice, incube as amostras a 65 graus Celsius por 20 minutos em uma incubadora. Após a incubação, deixe os tubos esfriarem até a temperatura ambiente e observe a cor final das amostras. Por fim, meça a absorção de amostras e padrões usando um espectrofotômetro em comprimento de onda de 550 nanômetros.

A coloração por colágeno do tecido hepático com Vermelho Picro Sirius, quando observada com iluminação de campo brilhante, mostrou vermelho de colágeno com fundo laranja claro ou amarelo. A deposição de colágeno correspondente à fibrose foi corada, assim como o colágeno nas paredes dos vasos sanguíneos, no hílio e na cápsula hepática. A microscopia de luz polarizada revelou fibras de colágeno birrefringentes distintas sobre um fundo escuro, aprimorando a visualização da fibrose.

A quantificação da área positiva para colágeno hepático em camundongos amarelos de agutí alimentados com dieta rica em gordura e frutose, ou HFFD, mostrou fibrose significativamente maior em comparação com camundongos controle selvagens alimentados com dieta baixa em gordura e frutose. A quantificação do conteúdo hepático de hidroxiprolina revelou um nível significativamente maior em camundongos amarelos de agouti alimentados com dieta HFFD em comparação com os camundongos controle após 16 semanas de dieta, confirmando aumento na deposição de colágeno em fígados fibróticos.